Development of MS- based immunoassays for transporter and cytochrome P450 quantification in human, rat and mouse

Abstract

CYPs and transporters are important for the turnover of xenobiotic compounds. Their expression levels and activity influence bioavailability and convey drug-drug interactions. Moreover, transporters mediate barrier maintenance of several organs such as the blood – brain - barrier and the placenta-barrier. Overexpression of export transporters in tumors can lead to multiple drug resistance. Therefore, they are investigated thoroughly during drug development. However, it is still difficult to establish conventional assays such as sandwich immunoassays to quantify these proteins because CYP and transporter families are homologous and additionally transporters are very hydrophobic. The objective of this thesis was to develop MS – based immunoassays for ABC and SLC transporters as well as CYPs in up to three species which are relevant for research and drug development. During this thesis, nineteen TXP – multiplex assays were successfully developed which allow the quantification of up to 14 transporters in human, rat and mouse as well as up to 18 CYPs in rat and mouse. In total this corresponds to 61 different proteins. Additionally, it was shown that the TXP methodology is sensitive enough to quantify the low abundant target proteins from whole cell lysates without further enrichment such as membrane enrichment. The developed TXP -assays were used to analyze several independent studies: The amounts of transporters quantified in healthy human liver tissue was well line with published data. The protein expression profile of pericentral and periportal murine hepatocytes was analyzed and correlated with published immunohistochemistry as well as RNA expression data. Furthermore, a cross species study investigating the effects of azole fungicides in human cell culture, rat and wildtype as well as humanized mouse models was analyzed. It could be shown that high dosed fungicide treatment induced CAR, PXR and AhR target proteins as well as that the extent of the response differed between the models.

CYPs und Transporter sind wichtige Bestandteile des Fremdstoffmetabolismus, deren Expression und Aktivität durch Nahrungsbestandteile und Medikamente moduliert werden. Sie beeinflussen die Bioverfügbarkeit von Medikamenten und vermitteln Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Medikamenten oder Nahrungs-bestandteilen. Des Weiteren sind Transporter an der Aufrechterhaltung von Blutschranken verschiedener Organe beteiligt wie zum Beispiel der Blut – Hirn – Schranke. Das Phänomen der multiple drug resistance wird unter anderem durch die Überexpression von Exportpumpen vermittelt. Da CYPs und Transporter an so vielen Prozessen beteiligt sind, werden sie während der Medikamentenentwicklung ausführlich untersucht. Allerdings ist es immer noch schwierig sie mit konventionellen Methoden wie zum Beispiel Sandwich - Assays zu quantifizieren, weil sie zu sehr homologen Proteinfamilien gehören und Transporter des Weiteren auch noch sehr hydrophob sind. Aus diesem Grund, war das Ziel dieser Arbeit MS-basierte Immunoassays zu entwickeln um ABC und SLC Transporter sowie CYPs in bis zu drei für die Forschung und Medikamentenentwicklung wichtigen Spezies zu quantifizieren. Es wurden neunzehn TXP-Assays entwickelt mit denen bis zu 14 Transporter in Mensch, Ratte und Maus sowie bis zu 18 verschiedene CYPs in Ratte und Maus gemessen werden können. Das entspricht insgesamt 61 verschiedenen Proteinen. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die TXP – Methode sensitiv genug ist, sodass auf zusätzlich Anreicherungsverfahren wie verzichtet werden kann. Die entwickelten TXP – Assays wurden verwendet um bei vier verschiedenen Studien CYPs und Transporter zu quantifizieren. Die in humanem Normalgewebe aus der Leber bestimmten Mengen sowie die Zonierung in Mausleber, stimmten gut mit den Literaturwerten überein. Des Weiteren wurde eine speziesübergreifende Studie zu den Effekten von Pyrrolfungiziden analysiert. Humane Zellkultur, Ratten und Wildtyp - sowie humanisierte Mäuse wurden als Modelle verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass die Fungizide in hohen Dosen die Expression von CAR, PXR und AhR Zielproteinen in den vier Modellen beeinflussen. Das Ausmaß der Antwort hängt jedoch von dem verwendeten Modell ab.