Entwicklung und Charakterisierung eines iPSZ basierten Differenzierungsprotokolls zu olfaktorischen Rezeptorneuronen

Abstract

Das Riechsystem ist einzigartig in unserem Organismus, da etwa fünf Prozent unserer Gene dem olfaktorischen System, vor allem den jeweiligen Odorant-Rezeptoren der Rezeptorneurone, zugeordnet werden können. Jedes Gen detektiert für einen anderen Rezeptor, jedes Rezeptorneuron exprimiert dabei nur einen einzigen Rezeptortyp und jeder Rezeptor reagiert auf eine andere Kombination und Intensität von Duftstoffen. Bisher sind nur sehr wenige Zuordnungen zwischen Duftstoff und Rezeptor bekannt. Dies ist nur einer von vielen Punkten, der wiederspiegelt, wie wichtig der Riechsinn für den Menschen ist. Auf den ersten Blick erscheint er als Sinn eher untergeordent, jedoch nimmt er unterbewusst einen sehr großen Stellenwert ein. Zudem ist der primäre (Seh-) Sinn weit besser untersucht und spielt in der aktuellen Forschungslandschaft eine deutlich höhere Rolle. Deshalb widmet sich diese Doktorarbeit einem noch rudimentär in der Forschung beleuchteten Sinnessystem unseres Körpers. Hierbei soll ein olfaktorisches Differenzierungsprotokoll, ausgehend von pluripotenten Stammzellen entwickelt und anschließend näher charakterisiert werden. Das Ziel ist es ein System zu entwickeln, mit dem man die in vivo Bedingungen des olfaktorischen Systems leicht zugänglich nachahmen kann und weitere Forschungsfragen damit beantworten kann. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden dafür folgende Arbeitsschritte experimentell bearbeitet:

I. Generierung von induziert pluripotenten Stammzellen aus humanen Keratinozyten Es wurden von drei unterschiedlichen, freiwilligen Spendern Haarproben entnommen und kultiviert. Daraus konnten primäre Keratinozyten gewonnen werden, die erfolgreich zu iPSZ lentiviral reprogrammiert wurden. Die generierten Stammzellen sind pluripotent und können in alle drei Keimblätter differenzieren. Sie bilden somit die Grundlage für die Etablierung des olfaktorischen Differenzierungsprotokolls.

II. Etablierung eines Differenzierungsprotokolls zur Gewinnung von olfaktorischen Rezeptorneuronen Die generierten iPSZ dienten als Ausgangsmaterial für die Entwicklung eines gerichteten, olfaktorischen Differenzierungsprotokolls. Hierbei stand die Anreicherung von OMP positiven Neuronen in der neuronalen Mischkultur im Fokus. Dies wurde durch die gezielte Verbesserung eines neuro-ektodermalen Protokolls durch die Zugabe von Wachstumsfaktoren zu bestimmten Differenzierungsstadien erreicht. Zusätzliche Variationen in den Zeitpunkten und Zeitabständen der einzelnen Differenzierungsschritte führte ebenso zu einer höheren Ausbeute an OMP positiven Zellen. Es konnte im Neuronen Stadium an Tag 74 eine 58-fach signifikant erhöhte OMP Expression im Vergleich zu Stammzellen gemessen werden.

III. Charakterisierung des gerichteten Protokolls anhand von detaillierten Genexpressionsanalysen Im letzten Arbeitsschritt wurde das entwickelte Protokoll mithilfe einer detaillierten Genexpressionsanalyse näher charakterisiert. Dabei wurden zu verschiedenen Differenzierungstadien Markergene untersucht, die spezifisch für die jeweilige embryonale olfaktorische Entwicklung sind. Zusätzlich wurde die Marker Expression auch auf Proteinebene überprüft. Es konnte so ein Schema erstellt werden, das die einzelnen Differenzierungsstadien mit den olfaktorischen Entwicklungsschritten in vivo in direkten Zusammenhang bringt. Signalkaskaden, die in der olfaktorischen Entwicklung und Neurogenese auftreten stimmen teilweise mit denen Verlaufskurven in vitro überein. Insgesamt lässt sich zusammengefasst sagen, dass das generierte Differenzierungsprotokoll zu großen Teilen die embryonale olfaktorische Entwicklung in vitro wiederspiegelt.