NMR Studies of RNA Degradation by the Archaeal Exosome Complex

Abstract

The exosome complex belongs to an evolutionarily conserved group of barrel–shaped molecular machines that have significant roles in RNA degradation and processing. This group comprises the major enzymes responsible for the 3’–5’ RNA degradation pathway, which are present in bacterial, archaeal and eukaryotic organisms. The archaeal exosome complex (260 kDa) consists of a hexameric core and a trimeric cap. The active sites with phosphorolytic exoribonuclease activity are located within the internal chamber of the hexameric core. To enter the catalytic chamber, the substrate RNA molecule needs to pass through the opening on top of the assembly, which is encircled by the trimeric cap structure. The cap structure interacts with RNA, which provides substrate specificity and improves the RNA degradation efficiency. The underlying molecular mechanism, however, remains elusive. Here, we resorted to the novel approaches in NMR spectroscopy to address how the exosome cap structure is able to modulate the exosomal function. To that end, we use the archaeal exosome complex from the thermophile organism Sulfolobus solfataricus that is particularly amenable to the NMR studies as it has full three-fold symmetry and is stable at higher temperature. During the PhD project, a long RNA binding surface was identified on the Rrp4–cap structure. It was shown that the RNA interacts with the exosome complex through four contact points that function independently from one another. Based on precise affinity measurements, we managed to deconstruct this multivalent exosome–RNA interaction and quantified the contributions of the individual contact points. This showed that the interaction contribution (“strength”) increases from the periphery of the cap structure towards the active sites, which provides a mechanism that favours base-by-base substrate ratcheting towards the active sites. In addition to this actively degraded RNA, two more “waiting” RNA molecules can be bound on the Rrp4–cap structure. Interestingly, the interaction energy between the RNA and the exosome cap is significantly reduced after the 3’ end of the “waiting” RNA is translocated into the exosome chamber, thereby preventing friction between the substrate and the exosome cap during processive degradation. Furthermore, this project also emphasises the capabilities and advantages of methyl TROSY NMR spectroscopy for the studies of large macromolecular assemblies.

Der Exosomenkomplex gehört zu einer evolutionär konservierten Gruppe von fassförmigen molekularen Maschinen, die bei RNA-Abbau und RNA-Verarbeitung signifikante Rollen aufweisen. Diese Gruppe umfasst die wichtigsten Enzyme, die für den 3'– 5'-RNA-Abbaupfad verantwortlich sind, die in bakteriellen, archaealen und eukaryotischen Organismen vorhanden sind. Der archaeale Exosomenkomplex (260 kDa) besteht aus einem hexameren Kern und einer trimären Kappe. Die aktiven Stellen mit phosphorolytischer Exoribonuklease-Aktivität befinden sich innerhalb der inneren Kammer des hexameren Kerns. Um in die katalytische Kammer einzutreten, muss das Substrat-RNA-Molekül durch die Öffnung auf der Oberseite der Anordnung hindurchgehen, die von der trimeren Kappenstruktur umschlossen ist. Die Kappenstruktur wechselwirkt mit RNA, die die Substratspezifität liefert und die RNA- Degradationseffizienz verbessert. Der zugrundeliegende molekulare Mechanismus ist jedoch noch unklar. Hier haben wir auf neue Ansätze in der NMR-Spektroskopie zurückgegriffen, um herauszufinden, wie die Exosomkappen-Struktur in der Lage ist, die exosomale Funktion zu modulieren. Zu diesem Zweck verwenden wir den archäischen Exosomenkomplex aus dem thermophilen Organismus Sulfolobus solfataricus, der besonders für NMR-Studien geeignet ist, da er eine volle Dreifachsymmetrie aufweist und bei höherer Temperatur stabil ist. Während des PhD-Projektes wurde eine lange RNA-Bindeoberfläche auf der Rrp4- Kappen-Struktur identifiziert. Es wurde gezeigt, dass die RNA mit dem Exosomenkomplex über vier Kontaktpunkte, die unabhängig voneinander funktionieren, interagiert. Basierend auf präzisen Affinitätsmessungen haben wir diese multivalente Exosomen-RNA-Interaktion analysiert und die Beiträge der einzelnen Kontaktpunkte quantifiziert. Dies zeigte, dass der Wechselwirkungsbeitrag ("Stärke") von der Peripherie der Kappenstruktur zu den aktiven Stellen hin zunimmt, was einen Mechanismus zur Verfügung stellt, der ein Basen-für-Basen Fortschreiten des Substrats in Richtung der aktiven Stellen begünstigt. Zusätzlich zu dieser aktiv abgebauten RNA können an der Rrp4-Kappen-Struktur zwei weitere "Warte"-RNA- Moleküle gebunden werden. Interessanterweise wird die Wechselwirkungsenergie zwischen der RNA und der Exosomkappe signifikant reduziert, nachdem das 3'-Ende der "Warte"-RNA in die Exosomenkammer transloziert ist, wodurch Reibung zwischen dem Substrat und der Exosomenkappe während des Abbauvorgangs verhindert wird. Darüber hinaus unterstreicht dieses Projekt auch die Eignung und Vorteile der Methyl-TROSY-NMR-Spektroskopie für die Untersuchung großer makromolekularer Komplexe.