Inhaltszusammenfassung:
Das Orf Virus (ORFV) gehört zur Gattung Parapoxvirus der Poxviridae. ORFV
zeichnet sich durch äußerst vorteilhafte immunstimulierende und protektive
Eigenschaften aus, die es für den Nutzen als vielversprechende rekombinante
Vektor-Vakzine interessant machen. Die vorliegende Arbeit umfasst die Neu- und
Weiterentwicklung von ORFV-Rekombinanten und die Charakterisierung deren
protektiven Eigenschaften sowie die Beschreibung von potentiellen neuen
Evasionsmechanismen und immunrelevanten Eigenschaften von ORFV.
Zur Herstellung und Selektion von ORFV-Rekombinanten wurden verschiedene
Methoden der Transfektion optimiert, um in ORFV infizierten Zellen eine höchst
mögliche Transfektionseffizienz zu erreichen. Die Etablierung der PCR für den
Selektionsprozess neuer Rekombinanten löste das Problem der Abhängigkeit von
Antikörpern, die gegen das inserierte Antigen gerichtet sind. Zudem ermöglichte der
Einsatz von Fluoreszenz-Markergenen eine Reduktion der Arbeitsschritte, die zum
Erhalt homogener Virus-Rekombinanten führen.
Des Weiteren wurden verschiedene ORFV-Rekombinanten hergestellt, in deren
Genom Fremdgene verschiedener Viren (BRV, BTV, AHSV, FMDV, RHDV und
Influenzavirus) eingefügt wurden. Die korrekte Insertion und Expression dieser Gene
wurden durch verschiedene molekularbiologische Methoden bestimmt und die
protektiven Eigenschaften einiger Rekombinanten wurden in vivo charakterisiert.
Die ORFV-Rekombinante D1701-V-VP1 konnte einen effektiven Schutz gegen
RHDV im natürlichen Wirt, dem Kaninchen, induzieren. RHDV verursacht eine
hochansteckende Erkrankung mit einer hohen Mortalitätsrate in Kaninchen. Da in
vitro Zellkultursysteme fehlen, stammen kommerzielle Impfstoffe aus der Leber von
RHDV infizierten Kaninchen. Bereits eine singuläre Immunisierung mit der
Rekombinanten D1701-V-VP1 war ausreichend, um eine vollständige Immunität
gegen eine letale RHDV Infektion in Kaninchen zu induzieren. Der induzierte Schutz
beruhte neben der spezifischen Antikörperantwort gegen RHDV vermutlich auch auf
einer Beteiligung von T-Zellen. Die generierte ORFV-Rekombinante stellt eine
attraktive Alternative zu herkömmlichen Vakzinen dar.
Eine weitere neu hergestellte Rekombinante (D1701-V-HAh5n) exprimiert das
Hemagglutinin (H5 HA), welches das Hauptimmunogen des hochpathogenen aviären Influenzavirus (HPAIV) Stamm H5N1 darstellt und virus-neutralisierende Antikörper
induziert. Die Immunogenität dieser ORFV-Rekombinante wurde nach
Immunisierungen von Mäusen mit anschließenden Belastungsinfektionen
verschiedener Stämme des HPAIV H5N1 charakterisiert. Die immunisierten Tiere
zeigten nach Infektion weder eine klinische Symptomatik noch einen Verlust an
Körpergewicht. Zudem waren vakzinierte Mäuse auch vollständig gegen das
heterologe humane Influenzavirus A Stamm H1N1 geschützt. Depletionsversuche in
vivo von CD4-positiven und/oder CD8-positiven T-Zellen wiesen darauf hin, dass
insbesondere CD4-positve T-Zellen für die Ausbildung der protektiven Immunität
notwendig waren.
Die in vivo Untersuchungen der protektiven immunologischen Charakteristika von
ORFV-Rekombinanten, welche die Glykoproteine des Pseudorabiesvirus (PRV)
exprimieren, zeigten eine ausgeglichene spezifische TH-1 und TH-2 Immunantwort.
Bis zu 24 Stunden nach ORFV Immunisierung konnte eine gesteigerte Aktivität von
Natürlichen Killerzellen und die Expression pro-inflammatorischer Zytokine (IL-1β, IL-
6, TNFα und G-CSF) nachgewiesen werden. Zu späteren Zeitpunkten und nach
einer zweiten ORFV Immunisierung war vermehrt die Sekretion von TH-2
spezifischen Zytokinen (IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13) im Serum der Tiere nachweisbar.
Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Interferon-α/β und γ Rezeptoren
essentiell für den Schutz vor einer PRV Infektion waren.
Pockenviren besitzen ein breites Genspektrum, das eine Umgehung der
Immunantwort des Wirts ermöglicht. So wurden die immunmodulatorischen
Eigenschaften von ORFV und dessen Einfluss auf den Prozess der
Antigenpräsentation über MHC I in infizierten Vero Zellen untersucht. Abhängig von
der Infektionsdauer war die MHC I Expression auf der Zelloberfläche bis zu 50%
reduziert. Zudem konnte bei infizierten Zellen eine verlängerte Halbwertszeit von
vorhandenen MHC I Molekülen an der Zelloberfläche nachgewiesen werden.
ORFV scheint die MHC I Oberflächenexpression herab zu regulieren, indem es direkt
die Struktur der Golgi Kompartimente und das vesikuläre Transportsystem angreift.
Dies wiederum hat Einfluss auf die Präsentation viraler Antigene und die Aktivierung
von T-Zellen. Zudem zeigten Analysen eine Ko-Lokalisierung zwischen MHC I und
COP-I Vesikeln sowie einen gestörten Glykosylierungszustand von post-ER MHC I
Molekülen.
Die beschriebenen Arbeiten demonstrieren eindrücklich die bemerkenswerten
Eigenschaften des ORFV Stamm D1701-V und dessen großes Potential als Vektor-
Impfstoff gegen virale pathogene Erreger.
