Automatisiertes Western Blotting im Hochdurchsatz: Charakterisierung des Differenzierungszustandes von zonierten Hepatozyten

Abstract

Die Leber ist das zentrale Stoffwechselorgan aller Wirbeltiere. Die kleinste funktionelle Einheit der Leber stellt das von periportaler (PP) nach perizentraler (PZ) Seite blutdurchflossene Leberläppchen (Lobulus) mit seinen metabolisch aktiven Hepatozyten dar. Obwohl die Hepatozyten morphologisch nicht unterscheidbar sind, sind ihre Enzymausstattungen und damit ihre Aufgaben entlang der Porto-Zentral-Achse divergent, weshalb der Begriff der metabolischen Zonierung geprägt wurde. Systematische Studien zur Untersuchung der Zonierung beruhten bis dato lediglich auf RNA-Expressionsanalysen der verschiedenen Bereiche des Leberläppchens. Um detaillierte Unterschiede in den funktionellen Eigenschaften der Hepatozyten zu erfassen, wurde in dieser Arbeit eine weitreichende Analyse des Proteoms von PZ und PP Hepatozyten durchgeführt. Diese beinhaltete die Analyse von posttanslationalen Modifikationen wodurch zentrale regulatorische Mechanismen in der Zellen abgebildet werden konnten. Um diese breite Abdeckung zu erreichen wurde neben der (1) Massenspektrometrie (MS) in einem Full-MS Ansatz sowie einer (2) MS-basierten Immunoaffintätsanalyse (3) das antikörperbasierte hochdurchsatz Western Blot System DigiWest eingesetzt. Eine Weiterentwicklung stellt die in dieser Arbeit etablierte und als (4) LiquiWest bezeichnete Technologie dar. Sie beruht auf dem DigiWest, besitzt jedoch durch zahlreiche Optimierungen sowie Automatisierungslösungen bei gleichbleibender Datenqualität und signifikant reduzierter Eingriffszeit eine erhöhte Reproduzierbarkeit sowie einen 5-fach höheren Durchsatz. Mit Hilfe der genannten Technologien konnten zonierte Hepatozyten auf ihre Proteinexpression hin detailliert analysiert werden. Von den insgesamt über 2000 detektierten Proteinen sowie deren Modifikationen wurden 120 als differenziell exprimiert detektiert. Dabei zeigten Stoffwechselvorgänge wie oxidoreduktive Prozesse, die Gluconeogenese, der Aminosäureabbau aber auch regulatorische Prozesse wie der MAP-Kinase- und der TGF-beta Signalweg eine signifikant periportale Zonierung. Dahingegen waren die Glycolyse, der Citratzyklus, der Purin- und Fremdstoffmetabolismus und vor allem der Wnt-Signalweg perizentral ausgeprägt. Um den Einfluss der Kultivierung auf den Differenzierungszustand von Hepatozyten zu beleuchten, wurde eine neue, schonende und gleichzeitig spezifische Trennmethode eingesetzt. Die Trennung nutzte die charakteristische Expression der Glutaminsynthetase (GS) in PZ Hepatozyten und erlaubte in einer gentechnisch veränderten Maus durch Reportergenexpression die Anreicherung von GS positiven (GS+) oder GS negativen (GS-) Zellen. Durch kontrollierte Zugabe von Wnt-Agonisten wurde ein in vivo naher Zustand in der Kultur eingestellt. Bei der Analyse von über 100 Proteinen aus verschiedenen Signalwegen zeigte sich trotz dieser Kulturbedingungen eine Dedifferenzierung über mehrere Tage hinweg.