Neutralization Recognition and Structural Features of Reovirus Attachment Protein σ1

Abstract

Virus attachment to the host cell surface and subsequent cell entry are key steps in viral infection. Neutralizing antibodies therefore often target virus proteins that mediate binding to cell receptors. Mammalian orthoreoviruses (reoviruses) are useful models for studies of viral pathogenesis and host immunity, and they are promising oncolytic agents and vectors for vaccines. The reovirus attachment protein σ1 engages junctional adhesion molecule-A (JAM-A) and sialylated carbohydrate receptors. During the acid-dependent proteolysis from virions to infectious subvirion particles (ISVPs), which accompanies cell entry, the σ1 protein is thought to undergo a structural rearrangement. In this thesis, the attachment protein σ1 of type 1 (T1) and type 3 (T3) reovirus were structurally analyzed in complex with antigen-binding fragments (Fabs) of the serotype-specific neutralizing antibodies 5C6 and 9BG5, respectively. The crystal structures allowed us to determine the complete antibody epitopes and to explain how reovirus variants can escape neutralization. Surface-plasmon resonance was used to investigate the interplay between JAM-A and antibody binding and to determine affinities of JAM-A and the Fabs for σ1. Together with the analysis of hemagglutination inhibition and cell-binding assays, we were able to propose a mechanism for how the antibodies neutralize reovirus infection. We observed strikingly different hemagglutination inhibition properties of 9BG5 for virions and ISVPs, a finding that provides additional evidence for a structural rearrangement of σ1 during virion-to-ISVP conversion. In order to gain insights into the region of σ1 that anchors the protein into the virus capsid and to investigate the regions of predicted enhanced flexibility, crystal structures of the T1 and T3 σ1 tail domains were solved at high resolution. Both proteins possess a heptad repeat pattern of hydrophobic amino acids and form stable trimeric α-helical coiled coils. A discontinuity of the heptad repeat is conserved in the serotypes, and with our structural investigation we were able to define how the heptad repeat break is compensated by the proteins. The structural analysis of a T3 σ1 construct composed of the tail and the body domain revealed an unexpectedly seamless transition between the two domains. This finding is in contrast to the predicted higher flexibility of σ1 within this region and requires a reconsideration of the current model. Sequence analysis indicates that the observed interactions that stabilize the tail-body junction of T3 σ1 are conserved within the other serotypes. Our investigation of the tail and the tail-body junction of σ1 enabled us to formulate a full-length model of the elongated σ1 protein at high-resolution and provide a platform for future studies to define the flexibility of this protein.

Die virale Zelladhesion, sowie der darauffolgende Eintritt in die Wirtszelle sind Schlüsselschritte einer Virusinfektion, weshalb daran beteiligte virale Proteine häufig Ziel neutralisierender Antikörper sind. Humane Orthoreoviren (Reoviren) dienen als Modelsysteme zur Erforschung viraler Pathogenität, sowie der Wirts-Immunität und sind zudem vielversprechende onkolytische Agenzien und Vektoren für Impfstoffe. Das Reovirus-Adhesionsprotein σ1 bindet „junctional adhesion molecule-A“ (JAM-A), sowie sialinsäurehaltige Co-Rezeptoren. Während des Reovirus-Zelleintritts findet ein säureabhängiger, proteolytischer Abbau zu „infektiösen subviralen Partikeln“ (ISVPs) statt. Es wird angenommen, dass das σ1 Protein dabei eine Strukturänderung durchläuft. Diese Arbeit befasst sich mit der strukturellen Analyse von Komplexen zwischen dem σ1 Protein von Serotyp 1 (T1) bzw. 3 (T3) mit antigen-bindenden Fragmenten (Fabs) der serotypspezifischen Antikörper 5C6 bzw. 9BG5. Durch die Strukturaufklärung konnten die Epitope bestimmt, und erklärt werden wie Reovirus-Varianten der Antikörperneutralisation entgehen können. Mittels Oberflächenplasmon-Resonanz Spektroskopie wurde das Bindevermögen von JAM-A gemeinsam mit den Antikörpern untersucht, sowie die Affinitäten von JAM-A und Fabs zu σ1 bestimmt. Zusammen mit der Analyse von Hämagglutinationshemmtests und Zelladhesionsuntersuchungen konnte ein Mechanismus der Antikörper vermittelten Infektionsneutralisierung aufgestellt werden. 9BG5 wies deutliche Unterschiede in der Hämagglutinationshemmung zwischen Viren und ISVPs auf, was ein weiteres Indiz für die Strukturänderung von σ1 während des Übergangs von Viren zu ISVPs darstellt. Um Einblicke in die σ1-Region zu erhalten, welche das Protein im Viruskapsid verankert und um vorhergesagte Regionen mit erhöhter Flexibilität zu untersuchen, wurden Kristallstrukturen mit hoher Auflösung der filamentösen „tail“-Domäne von T1 σ1 und T3 σ1 gelöst. Beide Proteine enthalten ein Wiederholungsmuster von hydrophoben Aminosäuren und bilden stabile α-helikale Bündel. Eine Diskontinuität im Wiederholungsmuster ist bei allen Serotypen konserviert. Anhand der Strukturen konnte gezeigt werden wie das σ1 Protein diese kompensiert. Die strukturelle Analyse eines T3 σ1 Konstrukts, welches die „tail“- sowie die „body“-Domäne beinhaltet, zeigt einen unerwartet nahtlosen Übergang der beiden Domänen, was im Gegensatz zur vorhergesagten, höheren Flexibilität dieser Proteinregion steht und eine Überdenkung des momentanen Models fordert. Sequenzanalysen deuten darauf hin, dass die beobachteten Interaktionen, die den Übergang der „tail“ und der „body“-Domäne von T3 σ1 stabilisieren bei den anderen Serotypen ebenfalls konserviert sind. Die Untersuchung der „tail“ und der „tail-body“ Konstrukte bieten eine Plattform zukünftiger Studien zur Flexibilitätsuntersuchung des σ1 Proteins und ermöglichten das Erstellen eines Modells über die gesamte Proteinlänge.