Stoichiometric and Structural Investigations of ciliopathy-related protein complex IFT-A

Abstract

Cilia are evolutionary conserved organelles which protrude from almost every polarized eukaryotic cell. These hair-like organelles are vital for human and animal development and physiology being associated with cell cycle and proliferation. Depending on its molecular structure cilia can be classified in motile and immotile cilia. Immotile cilia, also called primary cilia, are characterized by the lack of a central microtubule doublet and generally serve as sensory organelles. Based on the fact that cilia are present in cells and organs of the human body, malfunction of ciliary proteins and defects in cilia lead to a wide range of human diseases which are summarized under the term: ciliopathies. To understand the underlying mechanisms of ciliopathies, it is crucial to study processes within cilia. So far, no biosynthesis machinery is described within a cilium. To transport proteins from the cytoplasm to the tip of a cilium, which is essential for the ciliary assembly and its maintenance, the bidirectional intraflagellar transport (IFT) is necessary. This transport mechanism is driven by motor proteins and two multiprotein complexes IFT-A and IFT-B. IFT-A, consisting of six known complex components, is involved in retrograde transport of protein cargo from the ciliary tip back to the cell body. As described in previous studies, malfunction of IFT-A proteins leads to an accumulation of IFT-B particles in the ciliary tip which results in shortened and bulged cilia. Additionally, mutations within genes encoding IFT-A proteins are described to cause ciliopathies like Sensenbrenner syndrome which is characterized by ectodermal as well as skeletal anomalies. The presented study aims to investigate stoichiometric and structural properties of IFT-A, which is essential for the molecular function of IFT-A during intraflagellar transport and is assistant to unveil its role in IFT-A-related diseases. As basic prerequisite of this study, Flp-In monoclonal cell lines stably expressing N-terminally Strep-Flag (SF)-tagged baits were generated to circumvent the influence of artificial overexpression on stoichiometry of the protein complex. Three different baits were chosen: IFT122, an integral part of the IFT-A, TULP3 which is described to be associated with the IFT-A and LCA5 which represents an rather labile and transiently bound interaction partner of IFT-A. Using an integral part of the protein complex of interest (Flp-In (N)-SF-IFT122) led to a drastic change in complex composition. Due to the higher affinity of TULP3 to IFT-A compared to LCA5, higher amount of the IFT-A complex could be purified from Flp-In (N)-SF-TULP3 enabling a more robust determination of the stoichiometric and structural investigation. To determine complex stoichiometry performing absolute quantification, the establishment of a targeted mass spectrometry approach is crucial. Depending on the applied mass spectrometer, two different approaches were set up: Selected Reaction Monitoring (SRM) and Parallel Reaction Monitoring (PRM). Another important step for the absolute quantification is the generation of a standard mix containing known amounts of representative peptides for the proteins of interest. To create an economic equimolar standard mix, the already described “Equimolarity through Equalizer Peptide” (EtEP) method was used. At the end, absolute quantification performing PRM on a Q-Exactive mass spectrometer in combination with an equimolar standard mixture was used to study complex stoichiometry of IFT-A. Data analysis was performed using the software Skyline. This study unveiled naturally occurring compositions of IFT-A which change during different stages of ciliogenesis and cilia disassembly. To investigate the impact of disease causing variants on the composition of IFT-A, CRISPR/Cas9 system was used to generate targeted mutations within genes encoding two IFT-A proteins (IFT43 and WDR35) in Flp-In (N)-SF-TULP3 cells. One of the generated monoclonal cell lines, carrying a mutation in the gene encoding IFT43 (c.541_542insA/p.T181Nfs*2), showed significant changes within IFT-A complex composition that could explain the malfunction. The second part of this study aims to determine binding sites within IFT-A by chemical crosslinking in combination with mass spectrometry that serve as basis for structural models of IFT-A. For chemical crosslinking of purified IFT-A, the homobifunctional amine-reactive crosslinker dissuccinimidyl suberate (DSS) was used. This crosslinker contains two identical N-hydroxysuccinimidyl groups which enable the formation of stable amide bonds with primary amines of N-termini and lysine residues of proteins. Based on a defined spacer length of DSS (11Å), distance information of cross-linked peptides can be achieved. To enrich low abundant cross-linked peptides before LC-MS/MS analysis, size exclusion chromatography (SEC) is a common used prefractionation method. However, SEC is time-, labour- and cost-intense. A facilitated method to reduce sample complexity prior to the analysis of cross-linked peptides is portrayed in this study. This economic method is based on preseparation using 3kDa CutOff spin columns. For the identification of linked peptides the computational software pipeline xQuest/xProphet was used. To illustrate identified links, free available software Xinet was used afterwards. Identified crosslinks as well as cross-linked positions within a protein sequence using both preseparation methods were comparable. Applying chemical crosslinking to purified IFT-A, well-known interaction domains within the complex components were confirmed. Furthermore, new crosslinking hotspots which are not described so far were identified in this study. With the data obtained in this study, the foundation of a structural model of the IFT-A can be generated by combining the determined complex stoichiometry with obtained structural information of the protein complex IFT-A.

Zilien sind evolutionär konservierte Zellfortsätze, die auf fast allen polarisierten, eukaryotischen Zellen vorhanden sind. Diese sogenannten „Antennen der Zelle“ sind unverzichtbar für die Entwicklung von Mensch und Tier, da sie zum einen wichtig für die Zellfortbewegung sind aber auch Signale aus der Umwelt aufnehmen können. Basierend auf ihrer molekularen Struktur können Zilien in zwei Subtypen eingeteilt werden: bewegliche und unbewegliche Zilien. Während bewegliche Zilien ein zentrales Mikrotubuli-Dublett besitzen, fehlt dieses in unbeweglichen Zilien, die auch primäre Zilien genannt werden. Diese primären Zilien dienen in der Regel als Mechano- und Chemosensoren. Aufgrund des Vorkommens von Zilien im gesamten menschlichen Körper führen defekte Zilien und Fehlfunktionen in involvierten Proteinen zu unterschiedlichsten Krankheitsbildern wie z.B. zystische Nieren und Netzhautdegeneration. Diese Krankheiten sind unter dem Begriff Ziliopathien zusammengefasst. Um den Mechanismus, der Ziliopathien zu Grunde liegt zu verstehen, müssen die Prozesse innerhalb eines Ziliums untersucht werden. Bisher wurde keine Struktur innerhalb eines Ziliums beschrieben, welche Proteine und andere Biomoleküle, die für die Herstellung und Instandhaltung von Zilien notwendig sind, bereitstellt. Allerdings ist der Intraflagellare Transportmechanismus (IFT) bekannt, der mit Hilfe von Motorproteinen und den zwei Proteinkomplexen IFT-A und IFT-B essentielle Proteine von dem Zytoplasma in die Spitze des Ziliums und wieder zurück transportiert. IFT-A besteht aus sechs Komponenten und ist für den retrograden Transport (vom Zilium zurück zur Zelle) wichtig. Vorangegangene Studien beschreiben eine Akkumulation von IFT-B Partikeln in der Spitze des Ziliums aufgrund eines Defektes in dem IFT-A Komplex. Dies führt zu verkürzten und gewölbten Zilien, welche zum Beispiel zu Deformationen im Skelett führen können. Solche Anomalien sind in unterschiedlichen Ziliopathien beschrieben, wie z.B. Sensenbrenner Syndrom. Um den Einfluss von IFT-A auf Ziliopathien zu untersuchen, soll in dieser Studie die Stöchiometrie des Proteinkomplexes in der natürlich vorkommenden Zusammensetzung als auch die Struktur von IFT-A untersucht werden. Grundlegend für diese Arbeit war die Generierung von stabilen Flp-In Zelllinien, um keinen Einfluss auf die natürlich vorkommende Zusammensetzung von IFT-A durch artifizielle Überexpression zu nehmen. Für die Generierung wurden drei Ankerproteine, sogenannte Baits ausgewählt, die in unterschiedlicher Weise mit IFT-A in Zusammenhang stehen: IFT122 ist ein Teil des IFT-A Komplexes, ein assoziiertes Protein TULP3 und LCA5, welches ein labiler und transienter Interaktionspartner von IFT-A ist. Der Einsatz eines internen Proteins als Bait (wie z.B. IFT122) führt zu einer deutlichen Veränderung der Komplexzusammensetzung. Im Vergleich zu LCA5 besitzt TULP3 eine höhere Affinität zum IFT-A Komplex. Dies führt zu einer größeren Menge an aufgereinigtem IFT-A bei der Verwendung von Flp-In (N)-SF-TULP3, weswegen diese monoclonalen Zellen für die folgenden Experimente verwendet wurden. Um die Stöchiometrie eines Proteinkomplexes zu bestimmen, ist eine absolute Quantifizierung der einzelnen Komponenten des Proteinkomplexes notwendig. Für die absolute Quantifizierung mittels Massenspektrometrie wurden zwei unterschiedliche Methoden verwendet: Selected Reaction Monitoring (SRM) und Parallel Reaction Monitoring (PRM). Ein weiterer wichtiger Punkt für eine Absolute Quantifizierung ist die Auswahl von geeigneten und repräsentativen Standardpeptiden. Um einen kostengünstigen Standardmix mit equimolaren Mengen der ausgewählten, proteotypischen Peptide zu generieren wurde die Equimolarity through Equalizer Peptide (EtEP) Methode genutzt. Für die Bestimmung der Zusammensetzung von IFT-A wurde PRM auf einem QExactive Plus Massenspektrometer in Kombination mit einem equimolaren Standardmix zur Methode der Wahl. Die Datenanalyse erfolgte mit der freiverfügbaren Software Skyline. Diese Studie ermittelte die Stöchiometrie von natürlich vorkommendem IFT-A, welche während des Auf- und Abbau eines Ziliums variiert. Zusätzlich wurden durch CRISPR/Cas9 ausgewählte IFT-A Proteine (IFT43 und WDR35) in Flp-In (N)-SF-TULP3 Zellen gezielt mutiert, um die Auswirkung von krankheitsassoziierten Mutationen auf die Stöchiometrie des IFT-A zu beschrieben. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Identifizierung von Bindestellen innerhalb des IFT-A mittels chemischen Crosslinking. Die Kombination von chemischem Crosslinking mit Massenspektrometrie legt den Grundstein zur Strukturaufklärung und Generierung eines Strukturmodels von IFT-A. Aufgereinigtes IFT-A wurde mit dem homobifunktionalem Crosslinker Disuccinimidylsuberat (DSS) inkubiert, um primäre Amine in N-Termini als auch in Lysinen innerhalb der Proteinsequenzen zu vernetzen. Dafür ist die Amin-Reaktivität der verwendeten N-hydroxysuccinimidyl-Gruppen verantwortlich. Durch die definierte Länge des eingesetzten Crosslinkers (11Å) können Nachbarschaftverhältnisse über vernetzte Peptide identifiziert werden. Für die Identifizierung der vernetzen Peptide mittels Massenspektrometrie ist eine vorangehende Anreicherung dieser Peptide notwendig. Size exclusion chromatography (SEC) ist in diesem Zusammenhang eine gern genutzte Methode, die allerdings sehr kostenintensiv, zeit- und arbeitsaufwendig ist. Deswegen ist in dieser Arbeit eine vereinfachte Methode zur Reduktion der Probenkomplexität mittels 3kDa CutOff spin columns parallel zur SEC verwendet worden und beschrieben. Für die Identifizierung der vernetzen Peptide wurde die Software-Pipeline xQuest/xProphet verwendet. Die anschließende Visualisierung der Daten wurde mittels Xinet durchgeführt. Beide Anreicherungsmethoden erzielten vergleichbare Ergebnisse in der Art und der Positionen der identifizierten Crosslinks. Zusätzlich haben beide Methoden bisher beschriebene Interaktions-Domänen bestätigt als auch neue, bisher unbeschriebene Crosslink-Hotspots identifiziert. Mit Hilfe dieser Studie konnten sowohl bekannte Interaktionsdomänen innerhalb des IFT-A verifiziert, als auch neue unbekannte Bindestellen identifiziert werden. In Kombination mit der ermittelten Stöchiometrie des IFT-A legt diese Arbeit den Grundstein zur Generierung eines Strukturmodels dieses Proteinkomplexes, welches für die Aufklärung des Einflusses von IFT-A in Ziliopathien unabdingbar ist.