MULTIPLE WIRKWEISEN DES KONSTITUTIV EXPRIMIERTEN HUMANEN ANTIMIKROBIELLEN PEPTIDS (HBD1)

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URI: http://hdl.handle.net/10900/74620
http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-dspace-746201
http://dx.doi.org/10.15496/publikation-16024
Dokumentart: Dissertation
Date: 2017
Language: German
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Biologie
Advisor: Wehkamp, Jan (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2017-01-30
DDC Classifikation: 570 - Life sciences; biology
Keywords: Defensine , Redoxsystem , Peptide , Netz , Bakterien
Other Keywords: humanes beta-Defensin 1
Antimikrobielle Peptide
HBD1
Net formation
Redox regulation
Microbiota
Innate host defense
Antimicrobial peptides
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Inhaltszusammenfassung:

Mikroorganismen, wie Bakterien, Pilze und Viren, besiedeln kontinuierlich den menschlichen Organismus. Neben einer effektiven Barriere durch die Epithelschichten und teilweise mit Mukusschichten spielen in der Verteidigung antimikrobielle Peptide (AMPs) eine zentrale Rolle. Ein wichtiges AMP ist das humane β-Defensin 1, welches im Gegensatz, zu einigen anderen De-fensinen, ubiquitär von allen Epithelien produziert wird. Nach Reduktion der drei Disulfidbrü-cken erzielt das Peptid gegen viele anaeroben, aber auch gegen aerobe Bakterien eine toxische Wirkung. Die oxidierte Form (hBD1ox) zeigte eine spezifischere Aktivität auf Gram-negative Bakterien, darunter Escherichia coli (E. coli). Aufgrund der immer größer werdenden Anzahl an multiresistenten Keimen und dem daraus resultierendem Bedarf an neue Strategien für neue antimikrobiell aktive Substanzen, wurde hier der Wirkmechanismus beider Redoxformen ge-nauer untersucht. In dieser Arbeit konnten zwei Redoxproteine DsbA und DsbB im bakteriellen Periplasma identifiziert werden, welche essentiell für die Aktivität von hBD1ox sind. Dagegen wurde der Einfluss weiterer Proteine in der Außenmembran, Cytosol, sowie im Flagellum für die hBD1ox Aktivität ausgeschlossen. Ein weiterer Nachweis der Abhängigkeit des Redoxkomplex zeigte die Verwendung einer „Rescue“-Mutante, welche beide Redoxproteine auf einem externen Plasmid enthält, wodurch die Sensitivität auf hBD1 hergestellt wurde. Dies bestätigt, dass das DsbA/DsbB System eine notwendige Komponente für die antimikrobielle Aktivität von hBD1ox darstellt. Zusätzlich zeigten Bakterien ohne DsbA/DsbB System, im Gegensatz zum Wildtyp, eine geringere Anzahl an Membranvesikeln auf der bakteriellen Oberfläche, was mit einer niedrigeren Stressreaktion assoziiert ist. Durch eine Immunogold Färbung wurde hBD1ox in E. coli WT spezifisch im Periplasma lokalisiert. Dagegen konnte hBD1ox in der Mutante auch im Cytosol diffundieren. Es konnte somit gezeigt werden, dass hBD1ox mit DsbA und DsbB interagieren kann. Dies lässt die Hypothese zu, dass sich hBD1ox im Periplasma ansammelt und zusammen-lagert, was schließlich die Zelllyse induziert. Darüber hinaus konnte hier gezeigt werden, dass nur die reduzierte Form (hBD1red) Membran-schäden an Bakterien verursacht. Überraschenderweise zeigte die Rasterelektronen-mikroskopie nach der Behandlung mit hBD1red eine bisher noch unbekannte Netzstruktur, welche die Bakterien umgibt. Ein hier etablierter Transmigrationsassay zeigte, dass diese Netzstruktur die Diffusion und Verbreitung der Bakterien zusätzlich zu der antimikrobiellen Aktivität verhindern kann. Im Gegenteil zu anderen Defensinen, wie z .B HD6, ist die Aminosäure Cystein in der hBD1-Sequenz für die antimikrobielle Aktivität nötig und für die Netzbildung essentiell. Dies konnte durch einen Austausch mit einem Cystein-Analogon, welcher die Netzbildung verhindert, gezeigt werden. Zusätzlich wurde ein bakterieller Abwehrmechanismus von hBD1ox identifiziert, bei diesem bakterielle Proteasen in der Lage sind das hBD1red zu fragmentieren. Dadurch zeigt sich eine schwächere antimikrobielle Aktivität. Jedoch konnte die Netzbildung trotz des Proteaseverdaus nachgewiesen werden. Hier wurde zum ersten Mal gezeigt, dass ein Peptid mehrere Strategien besitzen kann, um antimikrobiell aktiv sein zu können. Dies dient für ein besseres Verständnis über die Wirkmechanismen von AMPs und könnte bei der Entwicklung neuer Strategien im Kampf gegen multiresistente Keime.

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