Durchflusszytometrische Diagnostik von Mikrometastasen im Wächterlymphknoten von Patienten mit malignem Melanom

Abstract

In unserer Arbeit etablierten wir eine neue Messmethode zur quantitativen Detektion von Mikrometastasen in Wächterlymphknoten von Melanompatienten. Hierzu wurde der Wächterlymphknoten (WLK) disaggregiert, anschließend mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gefärbt und durchflusszytometrisch auf Melanomzellen untersucht. Die WLK stammten alle von Melanompatienten der Universitäts-Hautklinik Tübingen, die eine Tumordicke von mindestens 1,0 mm, keine lymphogenen oder hämatogenen Makrometastasen hatten und bei denen mittels Lymphoszintigraphie einer oder mehrere Wächterlymphknoten identifiziert und exzidiert wurden. Wir etablierten zwei Färbestrategien. Für die erste Färbemethode wandten wir einen melanomzellspezifischen Antikörper (9.2.27 (Anti-MCSP)) sowie einen Lebend- Tot- Farbstoff an. Es wurden so insgesamt 105 Wächterlymphknoten gefärbt. Bei der zweiten Färbemethode wurden insgesamt drei melanomzellspezifische Antikörper verwendet: beteb (Anti-gp100), C3 (Anti-CD63) und 9.2.27 (Anti-MCSP, wie oben). So wurden insgesamt 53 Wächterlymphknoten gefärbt. Gemessen wurde mit dem Durchflusszytometer C6 Accuri von BD. Die Ergebnisse beider Strategien wurden jeweils mit den Ergebnissen der von Prof. Anja Ulmer an der Universitäts- Hautklinik Tübingen durchgeführten und 2014 publizierten Lymphozyten- Disaggregations- Immunzytologie (LDI) verglichen [ ]. Bei der LDI wird jeweils die Rate an HMB45+ Zellen pro Million Zellen (=Melanomzelldichte) angegeben. HMB45 ist, wie beteb, ein Anti-gp100-Antikörper. Bei unserer Methode wurden ebenfalls die Anzahl an Melanomzellen pro Million Zellen angegeben, wir nennen diese durchflusszytometrische Tumorzelldichte. Mit den Ergebnissen der LDI verglichen wurden jeweils der Status des Wächterlymphknotens (enthält mindestens eine Melanomzelle = positiv, enthält 0 Melanomzellen = negativ), es ergaben sich so an der LDI gemessene Sensitivitäten und Spezifitäten unserer Methode. Andererseits wurden bei Proben mit mindestens einer immunzytologisch diagnostizierten Melanomzelle die Melanom- mit den Tumorzelldichten verglichen und ihre Korrelation mithilfe des sog. Korrelationskoeffizienten Spearman’s ρ berechnet. Es ergab sich bei allen verwendeten Antikörpern und Färbestrategien eine positive Korrelation mit den Ergebnissen der LDI (höchster Korrelationskoeffizient ρ=0,8787 für 9.2.27+ und gleichzeitig beteb+ Zellen) und an der LDI gemessene Sensitivitäten von bis zu knapp 78% (für dreifach positive Zellen) sowie Spezifitäten von bis zu 91% (einfache 9.2.27- Färbung). Weiterhin ergab sich, dass die Melanomzelldichte möglicherweise einen Einfluss auf die durchflusszytometrisch messbare Gesamtzellzahl hat. Zum anderen zeigen unsere Ergebnisse, dass eine vorherige Konservierung der Proben mit PFA (Paraformaldehyd) die Zahl der im Durchflusszytometer zur Verfügung stehenden Zellzahlen erhöht und die Verklumpung der Proben senkt. WLK mit einer MZD > 100 zeigten durchflusszytometrisch deutliche Melanomzell-Populationen, die teils größer waren als die in der LDI ausgezählte MZD und eventuell eine genauere Tumorzelldichte angeben als diese. Wäre die im Durchflusszytometer diagnostizierte Tumorzelldichte tatsächlich genauer als die in der LDI ausgezählte MZD, hätte die Durchflusszytometrie ein noch größeres Potential zur realistischen Abschätzung des Todesrisikos bei klinisch vermutlich untertriebener Einstufung von Melanompatienten (vgl.[1]). Zusammenfassend halten wir die durchflusszytometrische Untersuchung der WLK von Melanompatienten zur quantitativen Analyse der darin enthaltenen Melanomzellen für eine praktikable Methode, sofern ihre Nachteile (große Zellzahlverluste, Verklumpung und Notwendigkeit einer Fixierung, hohe Sterberate der Melanomzellen) verbessert werden können. Für die weitere Anwendung der Methode würden wir eine Kombinationsfärbung mit mindestens zwei Antikörpern (9.2.27 und beteb) und eine Lebend-Tot-Färbung empfehlen. Vorschläge zur Verbesserung der o.g. Nachteile sind eine direkte Fixierung im geeigneten Medium (z.B. PFA), die sofortige Weiterverarbeitung und die Aufbewahrung in einem geeigneten Nährmedium (mit einer Salzlösung, Serumalbumin oder fetalem Kälberserum und pH-Wert-Stabilisatoren). Die Durchflusszytometrie soll neben der LDI mit histopathologischen/immunhistologischen Untersuchungen kombiniert werden, die immer noch der Goldstandard sind, weil sie eine qualitative und morphologische Beurteilung der Tumorlast sowie ihre Lokalisation innerhalb des WLK erlauben.