USP9x-vermittelte Strahlenresistenz in Glioblastomen

Abstract

Das Glioblastom ist bis heute eine Erkrankung mit infauster Prognose. Trotz aller Fortschritte der Strahlentherapie, der Chirurgie und der Chemotheraphie bleibt das Glioblastom eine unheilbare Erkrankung. Die Radiotheraphie zählt zusammen mit der Chirurgie zu den wichtigsten therapeutischen Verfahren in der Behandlung des Glioblastoms. Die Erforschung neuer Methoden zur Sensibilisierung des Tumors gegenüber Bestrahlung hat eine hohe Relevanz. Ein wichtiger Mechanismus, der zu Strahlenresistenz von Tumoren und T-Zell-Leukämien beiträgt, ist die Verhinderung der Apoptose durch Stabilisierung bzw. Überexpression anti-apoptotisch wirksamer Proteine wie Bcl-2, Bcl-xL und Mcl-1. Mcl-1 ist im Vergleich zu den anderen antiapoptotichen Proteinen der Bcl-2 Proteinfamilie ein kurzlebiges Protein mit einer kurzen Halbwertszeit, das in vielen Glioblastomen überexprimiert wird. Mcl-1 wird post-translational unter anderem durch E3-Ligasen und Deubiquitinasen reguliert. Die Deubiquitinase USP9x kann durch Abspaltung von Polyubiquitinketten Mcl-1 stabilisieren und dadurch Apoptose verhindern. In dieser Arbeit sollte überprüft werden, welche Rolle USP9x für die Mcl-1-Stabilität in Glioblastomzellen und die Entwicklung von Radioresistenzen spielt. Für unsere Versuche verwendeten wir die zwei Glioblastomzelllinien A172 und U373. In beiden wurde die Expression antiapoptotischer Proteine und USP9x, sowie die Apoptoseinduktion nach Bestrahlung untersucht. Nach Herunterregulierung von USP9x prüften wir dessen Rolle für die Mcl-1-Stabilität, die Induktion der Apoptose sowie das klonogene Überleben nach Bestrahlung. Anhand der Caspasenaktivierung, der DNA-Fragmentierung und des Zusammenbruchs des mitochondrialen Membranpotentials zeigten wir, dass die A172-Zellen nach Bestrahlung weniger Apoptose induzieren als die U373-Zellen. Beide Zelllinien induzieren jedoch weniger Apoptose nach Bestrahlung als Jurkat-Zellen. Beide Zelllinien wiesen hohe Mcl-1 und USP9x-Mengen auf. Nach Bestrahlung blieben die Mcl-1-Level in den A172-Zellen konstant, in den U373-Zellen nahmen sie kontinuierlich ab. In den A172-Zellen hatte die USP9x-Menge Einfluss auf die Mcl-1-Abundanz. In den U373-Zellen hatten erniedrigte USP9x-Level keinerlei Auswirkung auf die Mcl-1-Menge. Dies deutet auf eine USP9x-vermittelte Mcl-1-Stabilisierung in A172-Zellen hin. In beiden Zelllinien hatte sowohl eine Herunterregulierung von Mcl-1 als auch eine Herunterregulierung von USP9x eine Induktion der Apoptose zur Folge, welche bei den A172 stärker ausfiel als bei den U373-Zellen. Wahrscheinlich wird in den A172-Zellen die Induktion der Apoptose stark über Mcl-1 reguliert. In den U373-Zellen konnten wir eine hohe Abundanz des antiapoptotischen Bcl-2 nachweisen, welches eventuell die Relevanz von Mcl-1 bei der Apoptoseresistenz in diesen Zellen in den Hintergrund stellt. Unabhängig von der Art des Zelltodes führte eine Herunterregulierung von USP9x zu einer starken Abnahme des klonogenen Überlebens von A172-Zellen nach Bestrahlung. Aus unseren Ergebnissen schlossen wir, dass USP9x einen Radioresistenzfaktor in Glioblastomzelllinien darstellen kann. Auch in Glioblastomzellen scheint ein Zusammenhang zwischen der USP9x-Menge und der Mcl-1-Abundanz zu bestehen. Wahrscheinlich führen dabei hohe USP9x-Mengen in A172-Zellen zu einer Stabilisierung von Mcl-1. Eine Herunterregulierung von USP9x hatte in beiden Zelllinien keinen vermehrten Zelltod durch Apoptose zur Folge. Jedoch führte unabhängig von der Art des Zelltodes eine Herunterregulierung von USP9x zu einer Senkung des klonogenen Überlebens von A172-Zellen. Es existieren also weitere, Mcl-1-unabhängige Wege, über welche die Deubiquitinase USP9x eine Radioresistenz in Glioblastomen erzeugt. Eine USP9x-vermittelte Apoptoseresistenz durch Mcl-1-Stabilisierung, wie sie von Trivingo et al. für Jurkat-T-Zell-Leukämiezellen beschrieben wurde, konnte in bestrahlten Glioblastomzellen jedoch nicht gezeigt werden.