Gene-Silencing der Adhäsionsmoleküle P-Selectin (CD 62P) und PECAM-1 (CD 31) mittels small interfering RNA (siRNA) an humanen Endothelzellen der Vena saphena magna (HSVEC) unter dem Aspekt der Protektion aorto-koronarer Bypässe

Abstract

Aorto-koronare Bypässe unterliegen dem Risiko des Bypassversagens. Im Vergleich zu arteriellen zeigen sich an venösen Bypässen arteriosklerotische Veränderungen früher und umfassender, so dass im Durchschnitt 10 Jahre nach einer aorto-koronaren Bypassoperation nur noch etwa 50% der venösen Bypässe durchgängig sind. Am venösen Bypass beginnt bereits mit der Operation unter dem Einfluss von zirkulierenden Entzündungsmediatoren, Hypoxie und einer operationsbedingten Endothelschädigung, sowie aufgrund des Blutdruckanstieges auf ein arterielles Niveau eine sich stetig aufrechterhaltende Entzündungsreaktion. Diese führt zur Erhöhung der Gefäßpermeabilität und Einwanderung von Leukozyten über Adhäsionsmokeküle. Insbesondere sind Monozyten an der Entstehung von Plaques beteiligt. Unter den Adhäsionsmolekülen sind P-Selectin (CD 62P), E-Selectin (CD 62E), VCAM-1 (CD 106), ICAM-1 (CD 54) und PECAM-1 (CD 31) von Bedeutung. Im Rahmen dieser Arbeit sollte unter dem Aspekt der Bypassprotektion eine isolierte Hemmung der Oberflächenmoleküle P-Selectin (CD 62P) und PECAM-1 (CD 31) mittels interferierender RNA (siRNA) an humanen Endothelzellen der Vena sphena magna dargestellt werden. Mittels Durchflusszytometrie zeigte sich auf Proteinebene eine lediglich geringe Expression von P-Selectin auf Endothelzellen der Vena saphena magna, die auch nach Aktivierung der Endothelzellen mit pro-inflammatorischen Zytokinen nicht signifikant gesteigert werden konnte. Auf mRNA-Ebene bestätigte sich anhand einer quantitativen Real Time-PCR diese geringe Steigerung der Genexpression nach Aktivierung, so dass eine Anwendung spezifischer siRNA ergebnislos verlief. Da das Oberflächenmolekül PECAM-1 (CD 31) insbesondere entlang der Zell-Zell-Kontakte ständig stark exprimiert wird, konnte ohne Stimulation die Wirkung einer spezifischen siRNA untersucht werden. Dabei zeigte sich, dass nach einer Transfektion die zu PECAM-1 (CD 31) gehörige mRNA-Menge bereits signifikant um etwa 80% gesenkt werden konnte, während auf Proteinebene ein vergleichbarer Wert erst nach vier Transfektionen im Abstand von 24 Stunden erreicht wurde. Zurückzuführen ist dies vermutlich auf ein Netzwerk aus vesikulären Membranen unterhalb der Plasmamembran, das als Speicher für PECAM-1 dient und als lateral border recycling compartment (LBRC) bezeichnet wird. Eine letzte Versuchsreihe diente dem Vergleich der Stabilität einer nicht modifizierten siRNA-Sequenz mit einer chemisch modifizierten siRNA-Sequenz bei Kontakt mit Serum, Vollblut und Endothelzellmedium mit 2% Kälberserum. Ergebnisse aus der Gelelektrophorese zeigten eine Degradierung innerhalb von Minuten beider siRNA-Sequenzen bei Kontakt mit Serum und Vollblut und einen lediglich bei Kontakt mit Endothelzellmedium nachweisbaren Vorteil der chemisch modifizierten siRNA.