Structure, dynamics and function of proteins in the mRNA decay pathway

Abstract

RNA decay is an important mechanism in regulating steady state mRNA levels and thus in orchestrating gene expression to match the changing requirements of a cell. This study is concerned with the molecular mechanisms of three processes in the two branches of mRNA decay: Firstly, the interactions that give rise to phase separation leading to processing body (P-body) formation are studied. Secondly, we investigate the assembly pathway of the heteroheptameric LSm1-7 complex that interacts with the 3’ end of mRNAs in preparation of 5’-3’ decay. The third and main project is aimed to elucidate the interplay between structure, dynamics and function in the scavenger decapping enzyme DcpS that performs the last catalytic step in 3’-5’ mRNA decay. In vitro reconstitution of a cellular phase-transition process that involves the mRNA decapping machinery Components of the eukaryotic mRNA decay machinery can accumulate in small cytoplasmic foci named processing bodies (P-bodies).These result from a phase transition process and have been observed in many eukaryotic species, yet the molecular mechanisms of their formation remain largely unknown. In this work, we combine biophysical methods with microscopy to demonstrate that a minimal set of mRNA degradation machinery from S. pombe can undergo phase transition in vitro. The interactions permitting the formation of indefinitely expanding intermolecular networks is the contact between multiple helical leucine-rich motifs occurring in Dcp2 and Pdc1 and the LSm domain of Edc3. Interfering with this interaction blocks protein clustering in vitro and in vivo. Additionally, we describe the structure of the Pdc1 Ge-1C domain and its binding to the decapping complex as an additional interaction within P-bodies. Structure of the LSm657 complex: an assembly intermediate of the LSm1-7 and LSm2-8 rings LSm proteins are a varied protein family that is homologous to the Sm proteins in splicing These form a heteroheptameric ring around small nuclear RNA. The nuclear LSm2–8 (like Sm) complex and the cytoplasmic LSm1–7 complex play a central role in mRNA splicing and degradation, respectively. In contrast to the assembly pathway of the Sm complex, the assembly of the LSm complex is, has not been intensely studied yet. Here, we solved the 2.5 Å-resolution structure of the LSm assembly intermediate that contains LSm5, LSm6, and LSm7. The three monomers display the canonical Sm fold and arrange into a hexameric LSm657–657 ring. We show that the order of the LSm proteins within the ring is consistent with the order of the related SmE, SmF, and SmG proteins in the heptameric Sm ring. Nonetheless, differences in RNA binding pockets prevent the prediction of the nucleotide binding preferences of the LSm complexes. Using high-resolution NMR spectroscopy, we confirm that LSm5, LSm6, and LSm7 also assemble into a 60-kDa hexameric ring in solution and observe that the LSm domains adopt different angles depending on the number of monomers in the ring. With a combination of pull-down and NMR experiments, we show that the LSm657 complex can incorporate LSm23 in order to assemble further towards native LSm rings. In summary, our results identify LSm657 as a plastic and functional building block on the assembly route towards the LSm1–7 and LSm2–8 complexes. An excess of catalytically required motions inhibits the scavenger decapping enzyme The scavenger decapping enzyme (DcpS) hydrolyzes the 5’ cap structure of short capped mRNAs that are the product of the 3' to 5' mRNA decay pathway. Degradation of these fragments is important, as they otherwise could compete for translation initiation machinery. Here, we solved the crystal structure of the yeast DcpS enzyme in complex with m7GDP. The 80 kDa homodimer consists of an N-terminal and a C-terminal domain, where the two catalytic sites are located in between these domains. In the asymmetric enzyme:substrate complex one active site is arranged in a catalytically active conformation around the substrate, whereas the second active site adepts an open and unproductive state. The static structure indicates that protein dynamics are essential for substrate recognition and product release. Using methyl TROSY NMR spectroscopy and ITC, we show that DcpS can interact with two substrate molecules in a sequential manner. The first nanomolar binding event results in a change of the symmetric apo homodimer into a highly asymmetric DcpS:substrate complex. The newly formed open binding site in this complex can then recruit a second substrate with micromolar affinity. Using longitudinal exchange experiments we show that this second binding event leads to DcpS domain flipping motions, where the second binding site closes and the first one opens. These dynamics increase with increasing substrate excess and are up to two orders of magnitude faster than the catalytic rate. To correlate these motions with function, we designed a mutant enzyme where the flipping motions are reduced. Interestingly, this more static enzyme displays increased catalytic activity. Our results thus indicate that DcpS flipping motions that are required for product release can be disadvantageous for catalysis if they are much faster than substrate turnover. In summary, we present an example of how protein motions in enzyme complexes can modulate activity.

mRNA Abbau ist ein wichtiger Mechanismus, um die Gleichgewichtskonzentrationen von mRNAs zu regulieren und somit die Expression von Genen an die variablen Bedürfnisse einer Zelle anzupassen. Diese Arbeit beschäftigt sich mit den molekularen Mechanismen von drei Prozessen in den beiden Teilen des mRNA Abbaus: Zunächst werden die Interaktionen, die zu einer Phasentrennung und der Bildung von processing bodies (P-bodies) führen, untersucht. Zweitens wird der Assemblierungsweg des heteroheptameren LSm1-7 Komplexes, der vor dem 5’-3’ Abbau mit dem 3’ Ende von mRNAs interagiert, erforscht. Das Hauptprojekt zielt darauf ab, das Zusammenwirken von Struktur, Dynamik und Funktion des Dcs1p Enzyms, das den letzten Schritt im 3’-5’ Abbau katalysiert, zu beleuchten. In vitro Rekonstitution eines zellulären Phasenübergangsprozesses, der die mRNA Abbaumaschinerie beinhaltet. In Eukaryoten können sich Komponenten des 5’-3’ mRNA Abbauweges in P-bodies, kleinen zytoplasmatischen Foken, ansammeln indem sie eine Phasentrennung durchlaufen. Diese Foki sind in vielen eukaryotischen Spezies beobachtet worden, allerdings sind die molekularen Mechanismen, die ihrem Zustandekommen zugrunde liegen, größtenteils noch unbekannt. In dieser Arbeit kombinieren wir verschiedene biophysikalische und struktubiolgische Methoden mit Mikroskopie und zeigen, dass eine kleine Anzahl an Komponenten der mRNA Abbaumaschinerie aus S. pombe ausreichend ist, um in vitroeine Phasentrennung zu erreichen. Die Interaktion, die es erlaubt unbegrenzte intermolekulare Netzwerke auszubilden ist die Bindung von kurzen Leucin-reichen Motiven (HLMs) aus Dcp2 und Pdc1 an die LSm Domäne von Edc3. Störung dieser Interaktion führt dazu, dass sowohl in vitro als auch in vivo die Anhäufung dieser Proteine verhindert wird. Wir charakterisieren außerdem die Struktur der Pdc1 Ge-1C Domäne und ihre Interaktion mit dem Dcp1/Dcp2 Komplex, die ebenfalls in P-bodies stattfindet. Die Struktur des LSm567 Ringes: Ein Intermediat der LSm1-7 und LSm2-8 Ringe LSm Proteine sind eine diverse Proteinfamilie, die homolog zu den Sm Proteinen aus dem Spleißosom ist. Der nukleäre LSm2-8 Komplex und der cytoplasmatische LSm1-7 Komplex sind jeweils zentral für das Spleißen und den Abbau von mRNA. Im Gegensatz zu den Sm Proteinen ist der Assemblierungsweg der LSm Proteinen jedoch noch wenig verstanden. In dieser Arbeit haben wir die Struktur eines LSm Assemblierungsintermediats bei einer Auflösung von 2.5Å gelöst, das LSm5, LSm6 und LSm7 enthält. Die drei Monomere weisen eine kanonischen LSm Faltung auf und bilden zusammen einen hexameren LSm657-657 Ring. Wir zeigen, dass die Reihenfolge der Monomere im Ring konsistent mit der Reihenfolge der verwandten SmE, SmF und SmG proteine im heptameren Sm Ring ist. Allerdings verhindern Unterschiede in der RNA Bindestelle die Vorhersage der Nukleotidbindung der LSm Komplexe. Mittels hochauflösender NMR Spektroskopie bestätigen wir, dass LSm5, LSm6 und LSm7 auch in Lösung einen 60kDa großen hexameren ring bilden und beobachten, dass die LSm Domänen abhängig von der Anzahl der Monomere im Ring andere Winkel annehmen. Wir zeigen außerdem mit einer Kombination von NMR und Pull-down Experimenten, dass der LSm657 Komplex LSm23 inkorporieren kann und sich damit weiter in Richtung der nativen LSm Ringe entwickelt. Insgesamt identifizieren unsere Ergebnisse den LSm657 Komplex als ein plastisches und funktionales Assemblierungsintermediat der LSm1-7 und LSm2-8 Ringe. Ein Überfluss an katalytisch notwendigen Bewegungen des im Dcs1p Enzym hemmt seine katalytische Funktion. Das Scavenger Decapping Enzym katalysiert die Hydrolyse der 5’ Cap Struktur an kurzen mRNA Abbauprodukten, die aus dem 3’-5’ Abbauweg hervorgehen. Diese Fragmente müssen abgebaut werden, da sie ansonsten unproduktiv Bestandteile der Translationsmaschinerie binden können. Wir haben die Struktur des Scavenger Decapping Enzyms aus Hefe in Komplex mit seinem Inhibitor m7GDP gelöst. Das 80kDa große Homodimer besteht aus einer N- und einer C-terminalen Domäne, die beiden aktiven Zentren befinden sich in den beiden Spalten zwischen den Domänen. In diesem asymmetrischen Enzym:Inhibitor Komplex umschließt ein aktives Zentrum ein Molekül m7GDP in einem geschlossenen, aktiven Zustand, während das andere eine offene und inaktive Konformation annimmt. Die statische Struktur des Proteins legt nahe, dass Konformationsänderungen im Protein für die Freisetzung des Produktes und die Erkennung des Substrates nötig sind. Wir zeigen mit TROSY NMR Spektroskopie und ITC, dass Dcs1p sequenziell zwei Substratmoleküle bindet. Die erste Bindung erfolgt mit nanomolarer Affinität und führt zu einer Konformationsänderung vom symmetrischen freien Protein zu einem asymmetrischen Enzym:Substrat Komplex. Die dabei entstehende offene Bindestelle interagiert mit micromolarer Affinität mit einem zweiten Substratmolekül. Mittels ZZ-Austausch Experimenten konnten wir zeigen, dass die zweite Bindung eine Klappbewegung der N-terminalen Domäne hervorruft, die die zweite Bindestelle schließt und die erste öffnet. Diese Bewegungen nehmen mit steigender Substratkonzentration zu und liegen um bis zu zwei Größenordnungen über der beobachteten Katalyserate. Um die Zusammenhang zwischen dieser Bewegung und der Enzymfunktion zu etablieren, haben wir eine Mutante entworfen, in der die Klappbewegungen langsamer sind als im Wildtyp. Interessanterweise weist dieses Protein eine erhöhte Katalyserate auf. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Klappbewegungen, die für die Enzymfunktion notwendig sind, für die Aktivität des Enzyms von Nachteil sein können, wenn sie sehr viel schneller sind als der Substratumsatz. Zusammenfassend beschreiben wir hier ein neues Beispiel dafür, wie Proteinbewegungen die Aktivität eines Enzymes beeinflussen können.