Ultrastrukturelle Analyse der Aufnahme von Nanopartikeln in Trypanosoma brucei brucei

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URI: http://hdl.handle.net/10900/71967
http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-dspace-719671
http://dx.doi.org/10.15496/publikation-13379
Dokumentart: Dissertation
Date: 2016
Language: German
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Advisor: Duszenko, Michael (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2016-04-13
DDC Classifikation: 500 - Natural sciences and mathematics
Keywords: Trypanosomen , Nanopartikel , Endocytose
Other Keywords: Trypanosoma brucei
Endocytosis
Nanoparticle
License: Publishing license excluding print on demand
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Inhaltszusammenfassung:

Bis zum heutigen Zeitpunkt sind nur 5 Medikamente zur Behandlung der afrikanischen Schlafkrankheit (HAT) auf dem Markt, die aber alle aufgrund von starken Nebenwirkungen und Schwierigkeiten bei der Verabreichung nicht zufriedenstellend sind [51]. Nanopartikel könnten hierbei als Medikamenten-Carrier eingesetzt werden und einen neuen Therapieansatz bieten. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte deshalb zunächst die Toxizität der Silizium- und Eisenoxidnanopartikel auf Trypanosoma brucei brucei und Erythrozyten untersucht werden, um eruieren zu können welcher der Nanopartikel als möglicher Medikamenten-Carrier eingesetzt werden könnte. Die Siliziumpartikel waren ab einer Konzentration von ≥ 50µg/ml trypanozid und die TC50 gegenüber Erythrozyten lag bei 15,6µg/ml. Mittels Fluoreszenzmikrospie konnte gezeigt werden, dass die Siliziumpartikel in die Membran der Erythrozyten inserierten und somit zu deren Lyse führten. Die nackten Fe2O3 Partikel zeigten hingegen im getesteten Konzentrationsbereich von 0,1µg/ml - 1000µg/ml keinen Einfluss in der exponentiellen Wachstumsphase der Trypanosomen. Es kam jedoch ab einer Konzentration von 100µg/ml zu einer verkürzten stationären Phase, die mit steigender Konzentration deutlich zunahm. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden die Siliziumpartikel in Bezug auf die Medikamentenentwicklung zur Bekämpfung der HAT als ungeeignet eingestuft. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde daher ausschließlich mit den Eisenoxidnanopartikeln weiter gearbeitet. Im zweiten Teil der Arbeit sollte nun die Oberfläche der Eisenoxidnanopartikel hinsichtlich der Medikamentenentwicklung verbessert und die Toxizität der modifizierten Eisenoxidnanopartikel an Trypanosomen getestet werden. Um die nackten Fe2O3-Partikel während der Anwendung in Medium zu stabilisieren und ihre geringe Toxizität auf Trypanosomen noch weiter zu verringern, wurden sie zunächst mit unterschiedlichen Sialinsäurederivaten (AllylthioNeu5AC, APS, NANA) oder mit dem synthetischen Polymer Polyvinylalkohol (PVA) ummantelt. Bei der Negativkontrastierung der nackten Fe2O3 und der Fe2O3-PVA Partikel zeigte sich, dass die Agglomeration der Partikel durch den PVA-Mantel deutlich reduziert werden konnte. Deshalb wurde im weiteren Verlauf ausschließlich mit den Fe2O3-PVA Partikeln weiter gearbeitet. Darüber hinaus wurde die Oberfläche der Nanopartikel noch zusätzlich mit den Proteinen bovine serum albumin (BSA) oder mit humanem Transferrin (Tf) modifiziert, um eine Aufnahme in die Parasiten durch Pinozytose oder Rezeptor-vermittelte Endozytose zu sichern [129]. Alle drei Nanopartikel-Chargen (Fe2O3-PVA, Fe2O3- PVA- BSA, Fe2O3-PVA-Tf) wurden noch zusätzlich mit dem Fluorophor Fluoresceinisothiocyanat (FITC) modifiziert, damit die Aufnahmekinetik mittels Durchflusszytometrie untersucht und verglichen werden konnte. Keiner der genannten modifizierten Partikel zeigte im Bereich von 0,1µg/ml - 1000µg/ml einen inhibitorischen Effekt auf die Trypanosomen. Die hämolytische Wirkung der Fe2O3-PVA, Fe2O3-PVA-BSA und Fe2O3-PVA-Tf Partikel war ≤ 3%, weshalb diese Partikel als geeignete Kandidaten für den Medikamententransport eingestuft wurden. Im dritten Teil dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwiefern ein Proteinmantel für die Aufnahme der Eisenoxidnanopartikel nötig ist und ob Serumproteine einen Einfluss auf die Aufnahme der Partikel haben. Deshalb wurde die Aufnahmekinetik aller drei Eisenoxidnanopartikel (Fe2O3-PVA-DTAF, Fe2O3-PVA-BSA-FITC und Fe2O3-PVA-Tf-FITC) unter serumfreien und serumhaltigen Bedingungen mittels Durchflusszytometrie analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass es bei allen drei Partikeln in serumhaltigem Medium zu einem zeit- und konzentrationsabhängigen Anstieg im prozentualen Anteil der FITC-A positiven Zellen kam. Jedoch zeigte sich, dass bei allen drei Partikeltypen, unabhängig vom Proteinmantel, Konzentrationen bis zu 1000µg/ml nötig waren, um eine Aufnahme in ca. 80-95% der Zellen zu erreichen. Es zeigte sich ebenfalls, dass Inkubationszeiten von bis zu 12h bei den beiden proteinbeschichteten Partikeltypen und Inkubationszeiten bis zu 24h bei den unbeschichteten Fe2O3-PVA Partikeln für eine effiziente Aufnahme nötig waren. Diese langen Inkubationszeiten waren aufgrund der hohen Endozytoserate von Trypanosomen nicht zu erwarten gewesen [129]. Wurden die Versuche hingegen unter serumfreien Bedingungen durchgeführt, kam es bei den beiden proteinbeschichteten Partikeln während der 1-stündigen Inkubation ab einer Konzentration von ≥ 10µg/ml zu einem rasanten konzentrationsabhängigen Anstieg im prozentualen Anteil der fluoreszierenden Zellen. Die Aufnahme der unbeschichteten Fe2O3-PVA Partikel war hingegen selbst unter serumfreien Bedingungen kaum möglich. Bei einer Konzentration von 1mg/ml war nur bei ca. 20% der Zellen ein Fluoreszenzsignal messbar. So konnte gezeigt werden, dass bei der Entwicklung von Nanopartikeln als Medikamenten-Carrier sowohl die Wirkung von Serumproteinen als auch die Notwendigkeit eines Proteinmantels berücksichtigt werden sollte. Im letzten Teil der Arbeit sollte die Aufnahme der Partikel bestätigt und ihre Lokalisation innerhalb der Zelle mittels der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) analysiert werden. Es konnte sowohl die Aufnahme der Siliziumpartikel als auch die der Eisenoxidnanopartikel (Fe2O3-AllylthioNeu5Ac, Fe2O3-APS, Fe2O3-NANA, Fe2O3-PVA, Fe2O3-PVA-BSA-FITC, Fe2O3-PVA-Tf-FITC) unter serumhaltigen Bedingungen bestätigt werden. Alle Partikel befanden sich größtenteils in den Lysosomen oder in den Endosomen. Unter serumfreien Bedingungen konnte nur die Aufnahme der beiden proteinbeschichteten Partikel nachgewiesen werden. Die Nanopartikel konnten in der Flagellumtasche, in endozytotischen Vesikeln, Lysosomen und Autolysosomen gefunden werden. Es konnten ebenfalls zahlreiche multivesikuläre Strukturen in den Mitochondrien detektiert werden, was für eine autophagische Antwort der Zellen auf einen durch Nanopartikel induzierten Stress hindeutet. Dass es sich bei der Aufnahme der Fe2O3-PVA-BSA-FITC und Fe2O3-PVA-Tf-FITC Partikel um einen aktiven Prozess handelte, konnte ebenfalls mittels TEM bestätigt werden. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden die Siliziumpartikel als ungeeignet und die Eisenoxidnanopartikel als ein möglicher geeigneter Medikamenten-Carrier zur Bekämpfung der HAT eingestuft. Da die Eisenoxidnanopartikel keine Toxizität auf die Trypanosomen bis zu einer Konzentration von 1mg/ml zeigten und in den Lysosomen akkumulierten, könnte in Zukunft eine selektive Abtötung der Parasiten durch die Kopplung eines Nanobodies gegen ein konserviertes Epitop im GPI-Anker von VSG [187, 204] und die zusätzliche Kopplung eines spezifischen Inhibitors lysosomaler Cysteinproteasen einen neuen Therapieansatz bieten.

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