Recombinant pluripotency transcription factors for kinase studies and nanoparticle delivery

Abstract

Stammzellen besitzen komplexe regulatorische Netzwerke, die von den Transkriptionsfaktoren OCT4, SOX2, KLF4 und c-MYC (OSKM) gesteuert werden. Die transkriptionelle Aktivität und die Stabilität der OSKM Faktoren werden durch verschiedene posttranlationale Modifikationen (PTMs) geregelt, insbesondere, durch die Phosphorylierung. AKT, auch Protein Kinase B genannt, ist für die Selbsterneuerung und die Erhaltung der Pluripotenz von Stammzellen unentbehrlich. Sie phosphoryliert OCT4, SOX2 und KLF4 an mehreren Stellen. Allerdings ist das Phosphorylierungsmuster noch unbekannt. Im ersten Projekt dieser Studie haben wir ein in vitro Tool entwickelt, um die PTMs in den Transkriptionsfaktoren OSKM, vor allem diePhosphorylierung durch die AKT Kinase, erforscht. Die OSKM wurden in Insektenzellen (Sf9) mit Hilfe des Baculovirus-Expressionsvektor-Systems (BEVS) exprimiert. Der Einsatz von BEVS erlaubte eine hohe Expression von richtig gefalteten Proteinen, die ähnliche PTMs wie in Säugerzellen besitzen. Die rekombinanten OSKM Proteine wurden auf ihre Reinheit, nukleare Lokalisierung und die biologische Aktivität getestet. Darüber hinaus wurden durch die Massenspektrometrie-basierten Phosphoproteom Analysen neue AKT-Phosphorylierungsstellen in OCT4, SOX2 und KLF4 identifiziert. C-MYC und OCT4 wurden in unserem Labor als putative Phosphorylierung-Substrate der Aurora-Kinase A (AURKA), identifiziert. AURKA spielt eine wichtige Rolle im Zellzyklus und hat verschiedene Auswirkungen auf Krebs und Stammzellen. Im zweiten Projekt dieser Studie untersuchten wir die Interaktion zwischen AURKA, c-MYC und OCT4. Interessanterweise erhöhte AURKA die transkriptionelle Aktivität von c-MYC und OCT4, in einer Kinase–unabhängigen Regulation. MLN8237, ein spezifischer AURKA Inhibitor, regulierte die Transkription und die Proteinstabilität von c-MYC und OCT4 in murinen embryonalen Stammzellen, aber auch bei der Reprogrammierung von murinen embryonalen Fibroblasten. Zusammengenommen haben wir gezeigt, dass Aurka c-Myc und OCT4 stabilisiert und dass ihre Kinasefunktion in Stammzellen nicht benötigt wird. Es wurde gezeigt dass die ektopische Überexpression von OSKM die Reprogrammierung von ausdifferenzierten Stammzellen zu pluripotenten Stammzellen, induziert. Üblicherweise werden virale Vektoren zur Transduktion verwendet, was die Gefahr von genetischen Manipulationen durch die virale Integration in das Wirtsgenom, erhöht. Im dritten Projekt dieser Studie haben wir eine Integrationsfreie, proteinbasierte Reprogrammierungsmethode durch Verwendung von biologisch abbaubaren Chitosan-Nanopartikel (NPs), die mit OCT4 rekombinanten Proteinen beladen waren, entwickelt. NPs beförderten OCT4 zum Kern von humanen dermalen Fibroblasten und erlaubten eine anhaltende Freisetzung für die Ladung. Darüber hinaus stabilisierten in vitro die NPs die OCT4 Aktivität.