Analysis of β-catenin signaling by a novel combinatory approach consisting of Co-Immunoprecipitation and DigiWest

Abstract

The canonical Wnt-/β-catenin pathway plays an important role in regulating central physiological processes, such as cell proliferation, cellular metabolism, differentiation and apoptosis. Aberrant mutational activation of central players in this signaling pathway is closely linked to the modulation of the signaling status of the pathway and disease formation such as carcinogenesis. To functionally analyze the signaling state of the Wnt pathway, a focus was put on the detection of protein-protein complexes comprising the central regulator β-catenin, since it exerts its regulatory role by forming protein complexes. Information on interaction partners of β-catenin in different complexes is instrumental to decode observed changes in cellular signaling. To isolate these protein complexes consisting of β-catenin and differing interaction partners, classical Co-Immunprecipiation (Co-IP) was performed on various cell lines in which cell signaling was modulated by compound treatment in this thesis. Thereby, it was possible to characterize the state of signal transduction in these cell lines with a focus on the activity of the regulatory Wnt pathway. In addition, the approach was extended to allow the use of a recently developed class of intracellular binding molecules, called chromobodies. These binders can be expressed inside a cell and enable an „intracellular Co-Immunoprecipitation”, which gives insight into in vivo conditions by detecting endogenous bound target proteins. The protein complexes consisting of β-catenin and various interaction partners (e.g. α-catenin and GSK3 β) were precipitated and shown by immunoblotting. To obtain a higher resolution picture of the isolated β-catenin complexes, a novel Western blotting approach (DigiWest) could be employed. This Western blotting approach uses a bead-based microarray platform and allows probing of a low amount of precipitate with hundreds of antibodies and thereby a screening for interacting proteins. By using this throughput technique, the efficient characterization of cell lines, e.g. tumor cells, was enabled. In addition, the analysis of novel and well-known interaction partners of β-catenin was facilitated. In summary, a combinatory approach consisting of Co-IP and DigiWest was established. This approach is suitable for the detection and a wide ranging analysis of posttranslational protein modifications and protein-protein interactions as well as their impact on the surrounding signaling cascades. An additional advantage of the combinatory approach is the simplification of visualizing alterations between different sample types and drug treatments. It consitutes a versatile tool to study endogenous complexes and to identify dynamic protein-protein interactions in signaling cascades. This approach can generally be applied to analyze regulating pathways and to decipher cellular communication processes by precipitating proteins and their key interactions.

Der kanonische Wnt/β-Catenin Signalweg spielt eine wichtige Rolle in der Regulation zentraler physiologischer Prozesse wie beispielsweise Zellproliferation, Zellstoffwechsel, Differenzierung und Apoptose. Abnorme Aktivierungen von Schlüsselmolekülen durch Mutationen wirken sich auf den Signalzustand dieses Signalweges aus und stehen in engem Zusammenhang mit der Entstehung von Krankheiten, beispielsweise Krebs. Um den Signalstatus des Wnt Signalweges funktional zu analysieren, wurde der Fokus auf die Detektion unterschiedlicher Proteinkomplexen mit β-Catenin gelegt, welches eine zentrale regulatorische Rolle bei der Bildung solcher Komplexe spielt. Detaillierte Kenntnisse über verschiedene Interaktionspartner von β-Catenin in unterschiedlichen Proteinkomplexen sind notwendig, um mögliche auftretende Veränderungen in der zellulären Signalgebung zu entschlüsseln. Um diese aus β-Catenin und verschiedenen Interaktionspartnern bestehenden Proteinkomplexe zu isolieren, wurde in dieser Arbeit eine klassische Co-Immunopräzipitation (Co-IP) auf verschiedenen Zelllinien durchgeführt, deren zelluläre Signalgebung durch Behandlung moduliert wurde. Dadurch war es möglich, den Status der Signalübertragung, insbesondere des regulatorischen Wnt Signalwegs, in diesen Zelllinien zu charakterisieren. Zusätzlich wurde die Co-IP durch die Verwendung von kürzlich entwickelten intrazellulären Bindemolekülen, sogenannten Chromobodies, erweitert. Diese können innerhalb der Zelle exprimiert werden und ermöglichen eine „intrazelluläre Co-Immunopräzipitation“, welche durch die endogene Bindung an Zielproteine einen Einblick in den in vivo Zustand erlaubt. Proteinkomplexe, bestehend aus β-Catenin und verschiedenen Interaktionspartnern (z.B. α-Catenin und GSK3 β), wurden präzipitiert und mittels Immunoblot detektiert. Um eine höhere Auflösung der isolierten β-Catenin-Komplexe zu erhalten, wurde ein neuer Western Blot Ansatz (DigiWest) eingesetzt. Dieser Ansatz ist an eine Bead-basierte Mikroarray-Plattform adaptiert, welche es ermöglicht, eine geringe Menge an Präzipitat mit hunderten von Antikörpern zu untersuchen und dabei nach Interaktionspartner zu suchen. Durch die Verwendung dieses Durchsatzverfahrens ist eine effizientere Charakterisierung von Zelllinien möglich. Zudem können bekannte und neue Interaktionspartner von β-Catenin analysiert werden. Zusammenfassend wurde eine kombinatorische Methode, bestehend aus Co-IP und und DigiWest, entwickelt, welche sich für die Entdeckung und weitläufige Analyse posttranslationaler Proteinmodifikationen und Protein-Protein-Interaktionen sowie deren Auswirkung auf die umgebenden Signalkaskaden eignet. Ein großer Vorteil dieser Kombination ist die einfachere Möglichkeit Veränderungen zwischen unterschiedlichen Probentypen und Behandlungen aufzuzeigen. Es wurde gezeigt, dass die Methode ein vielseitiges Werkzeug darstellt, um endogene Komplexe zu untersuchen und dynamische Protein-Protein-Interaktionen in Signalwegen zu identifizieren. Diese Methode kann darüber hinaus allgemein für die Analyse regulierender Signalwege sowie für die Entschlüsselung zellulärer Kommunikationsprozesse durch die Präzipitation von Proteinen und ihren Schlüsselinteraktionen angewendet werden.