Untersuchung von Histon-Deacetylasen mittels chemischer Analysestrategien

Abstract

Histon-Deacetylasen (HDACs) spalten die Acetylgruppen von modifizierten Lysinresten. Die Lysin-Acetylierung ist eine posttranslationale Modifikation, die bei der Regulation der Funktion und Aktivität vieler Proteine eine wichtige Rolle spielt. Der damit verbundene Einfluss von HDACs auf zahlreiche zelluläre Prozesse machen sie daher zu vielversprechenden therapeutischen Angriffspunkten für die Wirkstoffentwicklung. Für eine eingehende Untersuchung der enzymatischen Eigenschaften, der Aktivität sowie der Spezifität von HDACs ist daher die Entwicklung von neuen, leistungsstarken Analysestrategien von besonderem Interesse. In dieser Arbeit wurden drei chemische Strategien entwickelt um die Spezifität, Aktivität und Interaktionspartner von HDACs zu analysieren. Die Synthese von isotopenmarkierten Reporterpeptiden ermöglichte die Etablierung eines NMR-spektroskopischen Assays, welcher eine Beobachtung von mehreren Deacetylierungen im gleichen Substrat erlaubt. Mit diesem Assay konnte die Selektivität der Deacetylasen Sir2.1 und HDAC8 in vitro sowie von endogenen HDACs aus HeLa-Kernextrakten am Histon-H4-tail analysiert werden. Ferner wurden kolorimetrische HDAC-Substrate entwickelt, die im Gegensatz zu vergleichbaren konventionellen Methoden eine größere Flexibilität in der Substratgestaltung erlaubten. Abschließend wurden Peptid-basierte Affinitätssonden entwickelt, mit denen die Substratselektivität und Zusammensetzung endogener HDAC-Komplexe analysiert werden kann. Mittels Kombination aus chemischer Synthese von Hydroxamat-Aminosäuren, die als HDAC-Inhibitoren fungieren, Festphasenpeptidsynthese und Affinitäts-Pulldown-Experimenten konnten Zink-abhängige HDACs aus humanen Zellextrakten isoliert werden. Der Einfluss auf die Interaktionsprofile der HDACs konnte durch Variation der Seitenkettenlänge der Hydroxamateinheit sowie des Sequenzkontexts der Acetylierungsstelle analysiert werden. Mithilfe dieser Methode konnten zudem die Präferenzen der HDACs aus HeLa-Zellextrakten für die Acetylierungsstelle K382 des Tumorsuppressorproteins p53 untersucht werden.

Histone deacetylases (HDACs) remove acetyl groups of modified lysine residues. Lysine acetylation is a post-translational modification which plays an important role in regulating function and activity of many proteins. The impact of HDACs on numerous cellular processes renders them promising targets for drug development. Detailed investigations on enzymatic properties, activity and specificity of HDACs require new and efficient analysis strategies. This thesis describes the establishment of three chemical strategies for the analysis of specificity, activity and interaction partners of HDACs. Synthesis of isotopically labeled reporter peptides enabled an HDAC assay based on NMR spectroscopy, which allows the observation of multiple deacetylation reactions within the same substrate. This assay was used for in vitro selectivity analysis of deacetylases Sir2.1 and HDAC8 as well as endogenous HDACs in HeLa nuclear extracts and histone H4 tail peptides as substrate. Furthermore, colorimetric HDAC substrates were developed. In contrast to conventional methods these peptides allow for greater flexibility in substrate design. Finally, peptide-based affinity probes were developed, which enabled investigation of substrate selectivity and composition of endogenous histone deacetylase complexes. Combination of chemical synthesis of hydroxamate amino acids, which operate as HDAC inhibitors, solid-phase peptide synthesis and affinity pulldown experiments were employed to isolate zinc-dependent HDACs from human cell extracts. The impact on HDAC interaction profiles were analyzed by varying the side chain length of the hydroxamate moiety as well as the sequence context of the acetylation site. The method was applied to investigate the preferences of HDACs in HeLa cell extracts for the acetylation site K382 on tumor suppressor protein p53.