Molekulare Diagnostik und Analyse von Tyrosinkinasen für eine individualisierte Therapie primärer Adenokarzinome der Lunge

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URI: http://hdl.handle.net/10900/69848
http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-dspace-698484
http://dx.doi.org/10.15496/publikation-11263
Dokumentart: Dissertation
Date: 2016-05
Language: German
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Pharmazie
Advisor: Ruth, Peter (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2016-05-03
DDC Classifikation: 500 - Natural sciences and mathematics
Keywords: Lungenkrebs , Rezeptor-Tyrosinkinasen , Diagnostik
Other Keywords: ALK
ROS1
LTK
Screeningmethode
qRT-PCR
IHC
Transkriptvarianten
targeted therapy
screening method
transcript variants
diagnostics
tyrosine kinase
NSCLC
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Inhaltszusammenfassung:

Die Entdeckung aberrant aktivierter Rezeptor-Tyrosinkinasen wie EGFR, ALK und ROS1 in nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen (NSCLC) und die Entwicklung von Inhibitoren, die spezifisch die Tyrosinkinaseaktivität hemmen, ermöglichen eine zielgerichtete Therapie und stellen einen großen Fortschritt in der Behandlung von Lungenkarzinomen dar. Die Inhibitoren wirken ausschließlich in Tumoren mit aktivierter Kinase, sodass eine zuverlässige Diagnostik essentiell für eine erfolgreiche Behandlung ist. Während EGFR-Mutationen mittels PCR-basierter Methoden und Sequenzierungen nachgewiesen werden können, sind FISH-Analysen als Diagnostikstandard für Genrearrangierungen bei ALK und ROS1 schwierig, zeit- und kostenintensiv. Im Rahmen dieser Arbeit wurden qRT-PCR-basierte Assays zur Identifizierung ALK- und ROS1-rearrangierter Tumore in der Routinediagnostik entwickelt, die für eine Verwendung an Paraffin-Gewebe konzipiert wurden, für Biopsie- und Resektatmaterial gleichermaßen geeignet sind und die aufgrund der gleichzeitigen Isolierung von RNA und DNA materialsparend mit der EGFR-Diagnostik kombiniert werden können. Der Nachweis basiert auf einer quantitativen Messung der exprimierten Fusionstranskripte, die Rearrangierungen anhand einer unbalancierten Amplifikation von Amplikons im 5‘- und 3‘-Bereich von ALK bzw. ROS1 zuverlässig nachweist. Die entwickelten qRT-PCR-Assays wurden auf große NSCLC-Serien angewendet (ALK: 976 NSCLC, ROS1: 671 NSCLC) und einer vergleichenden Analyse mit FISH und Immunfärbungen unterzogen. ALK- und ROS1-Rearrangierungen konnten zuverlässig und sensitiv anhand der unbalancierten Genexpression nachgewiesen werden. Zusätzlich wurden mit den qRT-PCR-basierten Analysen neue Subgruppen von NSCLC identifiziert, die eine erhöhte Gesamttranskript-Expression von ALK und ROS1 ohne Genrearrangierung besaßen. Da rearrangierte Tumore unabhängig vom Fusionspartner und gleichzeitig Tumore mit einer erhöhten Expression identifiziert werden können, eignet sich der qRT-PCR-Assay auch zum Nachweis von ALK- und ROS1-Rearrangierungen in anderen Tumorentitäten, sowie zum Nachweis einer Überexpression wie z. B. einer erhöhten ALK-Expression in Neuroblastomen. Da Immunfärbungen eine einfache und kostengünstige Screeningmethode darstellen, wurden in dieser Arbeit drei neu entwickelte ALK-IHC-Systeme (1A4, D5F3, D5F3/Ventana) in zwei Serien mit 250 bzw. 219 NSCLC (darunter 21 bzw. 20 ALK-rearrangierte NSCLC) sowie der ROS1-Antikörper D4D6 in einer Serie mit 251 NSCLC (darunter 8 ROS1-rearrangierte NSCLC) zum Nachweis von ALK- bzw. ROS1-Rearrangierungen getestet. Mit den ALK-Antikörpern wurden eine hohe Sensitivität von 95 – 100 % und eine Spezifität > 99 % erreicht. Auch die Sensitivität und Spezifität des ROS1-Antikörpers war mit einem falsch-positiv und einem falsch-negativ detektierten Fall sehr hoch, sodass im Ergebnis dieser Arbeit ein Screening auf ALK- und ROS1-rearrangierte NSCLC mittels Immunfärbungen empfohlen wird. ALK und ROS1 IHC-positive Tumore sollten zusätzlich mittels qRT-PCR oder FISH auf das Vorhandensein einer Rearrangierung getestet werden, da eine Unterscheidung zwischen Tumoren mit Rearrangierung und erhöhter Expression anhand der Proteinexpression nicht möglich ist. Mit diesem Vorgehen können NSCLC zuverlässig und kostengünstig sowie material- und zeitsparend auf ALK- und ROS1-Rearrangierungen untersucht werden. Weiterführende Analysen ergaben Hinweise darauf, dass auch die in einer Subgruppe von NSCLC (1 %) detektierte Expression von ALK-Transkripten ohne Genrearrangierung zu einer Aktivierung von ALK führen kann. Die Expression von nicht-rearrangiertem ALK führte zu einer detektierbaren Menge an ALK-Protein. In einem der Fälle wurde ein potentiell aktivierender Aminosäureaustausch in der Kinasedomäne (S220Y) identifiziert. Die ALK- Expression der nicht-rearrangierten NSCLC war mit der Genexpression der ALK-Liganden MDK und PTN sowie der Aktivierung des ALK-Targets STAT3 assoziiert, sodass ALK-exprimierende NSCLC-Zellen – in Analogie zu Neuroblastomzellen – mit ALK-Inhibitoren therapierbar sein könnten. In dieser Studie wurde bei 8 % der NSCLC eine deutliche ROS1-Expression ohne Genrearrangierung beobachtet; in 25 % dieser Fälle waren Transkriptvarianten von ROS1 exprimiert. Eine Sequenzanalyse von nicht-rearrangierten Fällen mit unbalancierter ROS1-Expression identifizierte 5 bislang nicht beschriebene Transkriptvarianten, denen eine unterschiedliche Anzahl von Exons im 5‘-Bereich fehlten. Die Transkriptvarianten führen bei einer Translation zu verkürzten ROS1-Proteinen, die alternative Funktionen besitzen und tumorigen wirken könnten. Bei einem dieser Tumore wurde die Expression eines ROS1-Proteins mit Kinase-Domäne beobachtet. Die Tyrosinkinase LTK ist aufgrund ihrer großen Homologie zu ALK ein interessanter Kandidat für eine zielgerichtete Therapie von NSCLC. In dieser Arbeit wurde erstmalig die Genexpression von LTK systematisch quantitativ und qualitativ in einer großen Serie von 542 NSCLC untersucht, sowie die Existenz von Genrearrangierungen in Lungenkarzinomen überprüft. Mit einer qRT-PCR-Analyse wurde in 9 % der NSCLC eine unbalancierte Expression des 3‘-Bereichs identifiziert. LTK-Rearrangierungen wurden anhand von FISH-Analysen nicht nachgewiesen und scheinen in NSCLC keine Rolle zu spielen. Eine Untersuchung auf potentielle Transkriptvarianten identifizierte eine neue, in NSCLC-Tumorzellen exprimierte, LTK-Variante, bei der die Exons 2 – 7 fehlen. Das potentielle Translationsprodukt enthält die Kinasedomäne, jedoch nur einen Teil des extrazellulären Bereichs und eine veränderte Transmembrandomäne, was sich auf Lokalisation und Regulierung der Kinase auswirken sollte. Somit ist eine aberrante Aktivierung der Kinase möglich, sodass LTK auch ohne Rearrangierung eine Relevanz für die Pathogenese und Therapierbarkeit von NSCLC besitzen könnte. Die in dieser Arbeit identifizierten tumorspezifischen Expressionen von ALK-, ROS1- und LTK-Transkripten und Transkriptvarianten ist potentiell in der Pathogenese einer Subgruppe von NSCLC beteiligt. In weiterführenden Studien muss geklärt werden, ob die entsprechenden Tumore mit spezifischen Inhibitoren therapierbar sind.

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