The role of Tight Junction Protein 1a and Leukocyte Tyrosine Kinase in the development and organisation of pigment cells in the Zebrafish

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URI: http://hdl.handle.net/10900/69822
http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-dspace-698228
http://dx.doi.org/10.15496/publikation-11236
Dokumentart: Dissertation
Date: 2016
Language: English
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Biologie
Advisor: Nüsslein-Volhard, Christiane (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2016-01-27
DDC Classifikation: 500 - Natural sciences and mathematics
570 - Life sciences; biology
Keywords: Pigmentmuster , Danio , Zebrabärbling , Genetik
Other Keywords:
iridophores
pigment cells
License: Publishing license including print on demand
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Inhaltszusammenfassung:

Wirbeltiere zeichnen sich durch die Neuralleiste aus; dabei handelt es sich um eine vorübergehende embryonale Struktur, deren Zellen zu einer Vielzahl von Geweben und Organen im adulten Tier beitragen. So stammen unter anderem die Pigmentzellen, die Chromatophoren, aus der Neuralleiste. Säugetiere und Vögel haben nur eine Art von Chromatophoren, die Melanozyten. Basale Wirbeltiere wie Reptilien, Amphibien und Fische, besitzen eine größere Bandbreite von spezialisierten Chromatophoren. Unterschiedliche Zusammenstellungen dieser Zellen sind für die Vielfalt der Farbmuster dieser Tiere verantwortlich, besonders beeindruckend bei den Teleostei. Zebrabärblinge, Dani rerio, zeigen ein sehr regelmäßiges Muster aus alternierenden dunklen und hellen Streifen, das aus 3 Pigmentzelltypen gebildet wird: Schwarzen Melanophoren, gelben Xanthophoren und silbernen Iridophoren. Die Bildung dieser Muster erfordert koordinierte Zellbewegungen und Zellformveränderung während der Metamorphose. Die Iridophoren spielen dabei eine besondere Rolle. Sie wechseln von einer dichten Form in den hellen Streifen zu einer losen Form in den dunklen Streifen. Es wurde vorgeschlagen, dass homotypische Interaktionen zwischen den Iridophoren die Zellteilung und Ausbreitung regulieren, während die Kommunikation mit Xanthophoren und Melanophoren die Aggregation bzw. Verteilung der Zellen entlang der dorso-ventralen Achse bestimmt, und somit das spätere Streifenmuster festlegt. Die molekularen Mechanismen, die diese Prozesse der Musterbildung kontrollieren, sind bislang noch wenig verstanden. In der vorliegenden Arbeit werden zwei neue Regulatoren des Zellverhaltens der Iridophoren beschrieben. In schachbrett (sbr) Mutanten sind die dunklen Streifen unregelmäßig und unterbrochen. Durch konfokale Mikroskopie und mit transgenen Linien konnten wir zeigen, dass in sbr Mutanten die Iridophoren nicht in der Lage sind, am richtigen Ort und zur richtigen Zeit von der dichten in die lose Form zu wechseln. Dadurch dringen dichte Iridophoren in die dunklen Streifen ein, sie vertreiben die Melanophoren, und verursachen Unterbrechungen. Wir haben gezeigt, dass der Phänotyp durch verkürztes Tight Junction Protein 1a (Tjp1a, ZO-1a) verursacht wird. Antikörperfärbungen und die Analyse von chimären Fischen deuten darauf hin, dass Tjp1a in dichten aber nicht losen Iridophoren exprimiert ist. moonstone Mutanten zeigen ektopische Iridophoren im Rumpf; bei den erwachsenen Fischen treten diese zusätzlich auch auf den Schuppen, Flossen und gelegentlich auf den Augen auf. Durch pharmakologische und genetische Ansätze konnten wir zeigen, dass moonstone ein dominantes Allel der leukocyte tyrosin kinase (ltk) ist, das eine Mutation trägt, die zum Austausch eines Aminosäurerestes in einer hochkonservierten Position der Kinasedomäne führt. Der Funktionsverlust von ltk in shady Mutanten, führt zur Abwesenheit von Iridophoren; das zeigt, dass ltk für die Spezifizierung der Iridophoren notwendig ist. Durch die Analyse der unterschiedlichen Allele, sowie durch den Einsatz eines pharmakologischen Inhibitors, konnten wir zeigen, dass Ltk in moonstone hyperaktiv ist. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass Ltk nicht nur für die Iridophorbildung wichtig ist, sondern später auch für ihre Proliferation und das Überleben. Unsere Untersuchungen von chimären Fischen weisen darauf hin, dass Ltk an der Kontrolle der Zellteilung der Iridophoren beteiligt ist, aber nicht die Kommunikation mit Xanthophoren und Melanophoren beeinflusst. Die aus Danio rerio bekannten Gene der Pigmentmusterbildung sind von Bedeutung für die Untersuchung von anderen Fischen, u.a. Guppys, Poecilia reticulata. Am Beispiel der beiden P. reticulata Mutanten golden und blue haben wir die konservierten Funktionen von zwei Tyrosin-Kinasen, Kita und Csf1a, aufgezeigt.

Abstract:

Vertebrates possess a unique structure, the neural crest, which contributes cells to a wide spectrum of tissues and organs, amongst them are pigment cells or chromatophores. In mammals and birds only one type of chromatophore is present – the melanocytes. However, more basal animals – reptilians, amphibians and fish – display an array of specialized chromatophores. Different arrangements of these cells produce an astonishing multitude of colouration patterns, especially in teleost fish. Zebrafish show a highly regular pattern of alternating dark and light stripes composed of three pigment cell types: black melanophores, yellow xanthophores and silvery iridophores. The formation of this pattern requires coordinated cell movements and cell shape changes of pigment cells during metamorphosis. Iridophores play a crucial part in this process by switching between the dense shape of the light stripes and the loose shape of the dark stripes. It has been suggested that homotypic interactions regulate iridophore proliferation and dispersal. Communication with xanthophores and melanophores, on the other hand, regulates a stereotypical sequence of aggregation and loosening, which establishes the stripes along dorso-ventral axis. However, not much is known about the molecular mechanisms that mediate the formation of the adult striped pattern. Analysing mutants obtained in several screens, we describe two novel regulators of iridophore behaviour. In the schachbrett (sbr) mutants the dark stripes are undulating or broken into spots. Using confocal microscopy and transgenic lines, we demonstrate that sbr iridophores are not able to switch from the dense shape to the loose shape in an appropriate spatio-temporal manner. As a result, dense iridophores invade the dark stripe areas, drive away melanophores, which leads to interruptions. We demonstrate that the phenotype is due to truncations of Tight Junction Protein 1a (Tjp1a, ZO-1a). Antibody labelling and chimeric analysis indicate that Tjp1a is expressed in the dense iridophores, but is down-regulated in the loose iridophores. The moonstone mutants display ectopic iridophores inside the trunk throughout development. In the adult fish, ectopic iridophores are present on the scales, in the fins and occasionally on the eyes. We demonstrate, using pharmacological and genetic approaches, that moonstone is a dominant allele of leukocyte tyrosine kinase, which carries a missense mutation in a conserved position of the kinase domain. Loss-of-function zebrafish mutants in ltk lack iridophores. Therefore, it has been suggested that ltk is required for iridophore specification. Using gain- and loss-of-function ltk alleles and inhibitor treatments, we show that mutant Ltk is hyperactive and that Ltk does not only specifically regulate iridophore establishment, but also proliferation and survival. Using chimeric analysis and confocal microscopy, we propose that Ltk facilitates the homotypic competition-based control of iridophore proliferation, but does not affect communication with xanthophores and melanophores. The question of the conversation of functions of the genes controlling pigment pattern formation is of prime importance in other model organisms, such as guppy. With the example of two guppy mutants, golden and blue, we demonstrate the conserved functions of two tyrosine kinases – Kita and Csf1ra.

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