Molecular taxonomic characterization of the human parasitic population of the nematode Strongyloides stercoralis in Cambodia and development and evaluation of methods for the genetic study of Strongyloides ratti

Abstract

Nematodes of the genus Strongyloides are common small intestinal parasites of vertebrates. They have a complex life cycle, which in addition to parthenogenetic parasitic adults also contains a facultative free-living adult generation, with males and females. The presence of sexually reproducing adults outside of the host offers opportunities for genetic research, which are quite unique for an endo-parasitic organism. Accordingly, Strongyloides spp. is developing into a model system for parasitological, basic biological and evolutionary studies.

In the first part of my thesis, I examined the Small Ribosomal Subunit rDNA (SSU) sequences from S. stercoralis larvae isolated from human patients in Cambodian highly S. stercoralis prevalent areas. Three polymorphic positions and three different haplotypes were identified within a region of the SSU normally considered to be essentially invariable within a nematode species. Interestingly, no hybrid individuals were found. These results suggested a low frequency of interbreeding between the different haplotypes in this area, either because S. stercoralis in this region reproduces only asexually or because crossing happens only within rather than between haplotypes.

Many research tools and techniques routinely used in model organisms like Caenorhabditis elegans are not yet available for Strongyloides spp. One of these methods is mutagenesis using chemical mutagens. In the second part of my thesis I devised a protocol to mutagenize S. ratti with the chemical mutagen Ethyl Methanosulfonate (EMS). Using this protocol, I generated S. ratti mutants with a higher proportion of animals developing into the parasitic form. As a control, I also attempted to obtain the same effect by selection only, in absence of EMS. Next I evaluate the possibility of identifying the mutated genes by whole genome sequencing of multiple mutagenized and selected strains. While this approach appeared promising, I also found that the currently used laboratory strain is not sufficiently isogenic such that the number of resulting candidate mutations, which need to be tested is rather high. The strong population bottlenecks associatiated with the mutagenesis and selection procedures reduced the genetic complexity of the populations significantly. This demonstrated that generating a more isogenic S. ratti strain for genetic work is possible.

In the third part of my thesis I isolated and characterized Strongyloides mariner-like transposons (SMARTs). Contrary to S. ratti, in S. papillosus several copies of SMART appeared potentially active. These transposons have the potential to be used as genetic tools as it has been demonstrated for the related Tc1 transposons in C. elegans.

Nematoden der Gattung Strongyloides sind weit verbreitete Dünndarmparasiten von Wirbeltieren. Der komplexe Lebenszyklus beinhaltet neben parthenogenetischen parasitischen Adulttieren auch eine fakultative frei lebende Generation mit Männchen und Weibchen. Die Existenz von Geschlechtstieren außerhalb des Wirts eröffnet Möglichkeiten für genetische Studien, die für Endoparasiten außergewöhnlich sind. Dementsprechend entwickelt sich Strongyloides spp. zu einem Modellsystem für parasitologische, grundlagenbiologische und evolutionsbiologische Studien.

Im ersten Teil meiner Doktorarbeit untersuchte ich die Sequenzen der rDNA für die kleine ribosomale Untereinheit (SSU) von S. stercoralis Larven aus Patienten in Regionen Kambodschas mit hoher S. stercoralis Prävalenz. Ich identifizierte drei polymorphe Positionen und drei verschiedene Haplotypen in einem Abschnitt der SSU, der normalerweise als praktisch invariable innerhalb einer bestimmten Art gilt. Interessanterweise gab es keine Hybride. Dieses Resultat lässt vermuten, dass sich S. stercoralis in dieser Gegend ausschließlich parthenogenetisch vermehrt, oder dass Kreuzung nur innerhalb, aber nicht zwischen den Haplotypen vorkommt.

Viele Methoden, die in Modellorganismen wie C. elegans routinemäßig angewandt werden, sind für Strongyloides spp. noch nicht verfügbar. Eine davon ist die Mutagenese mittels chemischer Mutagene. Im zweiten Teil meiner Doktorarbeit erarbeitete ich ein Protokoll zur Mutagenese von S. ratti mit Ethyl Methanosulfonat (EMS). Ich isolierte mutante S. ratti Linien, die sich zu einem größeren Anteil zu parasitischen Individuen entwickelten. Als Kontrolle versuchte ich den gleichen Effekt auch durch reine Selektion, ohne Mutagen zu erzeugen. Ich testete ich, ob es möglich ist die mutierten Gene durch Genomsequenzierung der mutanten und selektierten Linien zu identifizieren. Der Ansatz erwies sich als vielversprechend, Allerdings fand ich, dass der momentan verwendete Laborstamm nicht ausreichend isogen ist. Die Anzahl der isolierten Kandidatenmutationen, die getestet werden müssten, stellte sich deshalb als recht hoch heraus. Die mutagenisierten und selektierten Linien, die in Folge des Experiments durch starke "population bottlenecks" gegangen waren zeigten eine deutlich reduzierte genetische Variabilität. Dies zeigte, dass es möglich ist, einen mehr isogenen S. ratti Stamm für genetische Arbeiten zu erzeugen.

Im dritten Teil meiner Doktorarbeit isolierte und charakterisierte ich "Strongyloides mariner-like Transposons" (SMARTs). Anders als in S. ratti fand ich in S. papillosus mehrere möglicherweise aktive SMART Kopien. Diese Transposone haben das Potential als genetischen Werkzeugen benutzt zu werden, wie dies für die verwandten Tc1 Transposone in C. elegans der Fall ist.