MyD88 mutations in B cell tumors: constitutive signaling by TIR domain oligomerization

Abstract

Myeloid differentiation primary response 88 (MyD88) is the key adaptor protein that mediates signals upon activation of Toll-like receptors (TLR) and the IL-1 receptor (IL-1R). MyD88 consists of a Toll/IL-1R (TIR) domain that interacts with TIR domains of receptors or other adaptor proteins, whereas the death domain (DD) recruits downstream IL-1R-associated kinases (IRAKs) to form the so-called Myddosome signaling complex. A leucine to proline substitution of the amino acid residue 265 (L265P) within the TIR domain of MyD88 has recently been described as a very frequent somatic mutation in several types of B cell non-Hodgkin lymphomas, all of which are associated with considerable mortality; i.e. diffuse large B cell lymphoma (DLBCL), Waldenström’s macroglobulinemia (WM), mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma (MALT) and chronic lymphocytic leukemia (CLL). Recent reports revealed MyD88 L265P strongly increases binding and activation of IRAK1 as well as Bruton’s tyrosine kinase (BTK), thus these interactions are suggested to sustain cancer cell survival by constitutive activation of the transcription factor NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells). However, the precise molecular events leading to NF-κB hyperactivation and whether other B cell-intrinsic pathways are affected still remains unknown. In an effort to address these questions we found that the hyperactive phenotype of MyD88 L265P is caused by increased oligomerization propensity of the mutated TIR domain. L265P TIR domains in contrast to WT TIRs were alone able to trigger cell activation by strongly interacting with and therefore utilizing WT MyD88, possibly explaining why heterozygous mutation could be sufficient to trigger tumorigenesis. Confocal microscopy revealed cytosolic aggregation of TIR-mutants. MyD88 L265P colocalized with IRAKs indicating that L265P mutant assembly of oligomeric Myddosome post-receptor complexes leads to cell activation. Furthermore, cell lysates of L265P-mutated lymphoma cell lines contained complexes of high molecular weight including MyD88 and IRAK1, indicative for Myddosomes and confirming the aggregation phenotype of the mutant. Consequently blocking MyD88 oligomerization induced death of L265P-mutated but not WT DLBCL cells. Preliminary data indicate that L265P alters binding of MyD88 to several proteins which are important for regulatory circuits in B cell carcinogenesis. We plan to corroborate these findings in primary tumor cells and in vitro murine models, and propose to evaluate and utilize novel insights of how L265P may modulate tumor cell persistence by using small molecule inhibitors targeting the newly discovered interaction partners.

MyD88 (myeloid differentiation primary response 88) ist ein wichtiges Adapter-Protein das Signale von aktivierten Toll-like Rezeptoren (TLRs) und dem Interleukin-1-Rezeptor (IL-1R) weiterleitet. MyD88 besteht aus einer Toll/IL-1R-Proteindomäne (TIR) welche mit TIR-Domänen von Rezeptoren oder weiteren Adapter-Proteinen interagiert. Über die sog. DD-Proteindomäne (death domain) von MyD88 werden IL-1R-assoziierte Kinasen (IRAKs) rekrutiert wobei alle Proteine zusammen sog. Myddosomen bilden, aktivierte Signalkomplexe von hohem Molekulargewicht. In Studien wurde gezeigt, dass die MyD88 TIR-Domäne häufig in diversen B-Zell Non-Hodgkin-Lymphomen mutiert ist. Dazu gehören Neoplasien mit hoher Todesfolge wie z.B. das diffuse großzellige B-Zell-Lymphom (DLBCL), Waldenströms Makroglobulinämie (WM) oder die Chronische lymphatische Leukämie (CLL). Meistens entsteht durch Punktmutation im MYD88-Gen ein Austausch der 265. Aminosäure von Leucin zu Prolin (L265P). Studien konnten belegen, dass die L265P-Mutation eine starke Bindung von MyD88 mit IRAK- und BTK (Bruton-Tyrosinkinase) verursacht. Beide Kinasen waren dabei phosphoryliert und somit aktiv, was eine konstitutive Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) auslöste. Es ist davon auszugehen, dass letztendlich die erhöhte Expression anti-apoptotischer Gene durch hyperaktives NF-κB zur Persistenz von malignen Tumorzellen führt. Jedoch sind die genauen Vorgänge die zu dieser Hyperaktivierung führen nicht im Detail verstanden. Die vorliegende Arbeit beschreibt einen bisher unbekannten Mechanismus der Krebsentstehung: Expression von L265P-mutierten TIR-Domänen waren im Vergleich zu WT TIRs alleine ausreichend um NF-κB zu aktivieren. Die Mutante offenbarte dabei eine starke Bindungsaffinität zu sowohl mutierten, als auch WT TIR-Domänen, was eine wirksame Oligomerisierung von MyD88 Molekülen zur Folge hatte. Dieser Umstand wäre auch eine Erklärung dafür, dass eine heterozygot vorliegende MyD88-Mutation, wie es in den allermeisten Fällen von Lymphomen der Fall ist, ausreichend für die Krebsentstehung wäre. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zeigten Protein-Aggregation von L265P-mutierten TIR-Domänen im Zytoplasma. Weiterhin konnten wir Co-Lokalisation von MyD88 L265P mit verschiedenen IRAK Kinasen nachweisen, was vermuten lässt dass es sich bei beschriebenen Aggregaten um Myddosomen handelt, welche letztendlich zur Aktivierung von Signalwegen führen. Nach Zentrifugation von DLBCL Zelllysaten konnten wir mutiertes MyD88 in Komplexen mit hohem Molekulargewicht nachweisen. Diese Komplexe in L265P-mutierten Zellen enthielten auch mehr IRAK1 im Vergleich zu den MyD88 WT Zellen. Das weist darauf hin, dass eine L265P-bedingte Bildung von aktiven Myddosom-Aggregaten auch in DLBCL stattfindet. Folgerichtig konnten wir durch Blockieren der TIR-Oligomerisierung ein gezieltes Abtöten von MyD88 L265P-mutierten DLBCL Zelllinien erreichen. Weiterhin deuten vorläufige Daten an, dass die MyD88 L265P-Mutation auch die Affinität zu weiteren Proteinen verändert, welche eine wichtige Funktion in der B-Zell Onkogenese einnehmen. Diese Erkenntnisse sollen sowohl in primären Tumorzellen als auch in einem in vitro Mausmodell bestätigt werden. Wir hoffen, dass sich unsere Neuentdeckungen als nützlich erweisen und planen deshalb zur Evaluierung, kon-stitutiv-aktivierte Signalwege in MyD88-mutierten Lymphomen pharmakologisch zu inhibieren.