Identifizierung chemischer und pharmakologischer Chaperone zur Korrektur trafficking-defizienter Zapfen CNG-Kanäle

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URI: http://hdl.handle.net/10900/68549
http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-dspace-685498
http://dx.doi.org/10.15496/publikation-9968
Dokumentart: Dissertation
Date: 2016
Language: German
Faculty: 4 Medizinische Fakultät
4 Medizinische Fakultät
Department: Medizinische Fakultät
Advisor: Wissinger, Bernd (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2016-02-15
DDC Classifikation: 500 - Natural sciences and mathematics
610 - Medicine and health
Keywords: Bioassay
Other Keywords: Achromatopsie
CNG-Kanal
trafficking-Defekt
License: Publishing license excluding print on demand
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Inhaltszusammenfassung:

Die autosomal rezessiv vererbte Achromatopsie ist eine seltene, retinale Erkrankung, welche sich durch eine Beeinträchtigung der Zapfenphotorezeptorfunktion auszeichnet. Bei der Mehrheit der Patienten liegen Mutationen in CNGA3 und CNGB3 vor, welche für die Untereinheiten des zyklisch Nukleotid-gesteuerten (CNG) Ionenkanals im Zapfenaußensegment kodieren. Die CNG-Kanäle nehmen eine essentielle Rolle bei der Phototransduktion der Zapfenphotorezeptoren ein. Für zahlreiche Mutationen in der CNGA3-Untereinheit wurde in heterologen Expressionssystemen eine Beeinträchtigung des traffickings der CNG-Kanäle nachgewiesen. Diese führt zu einer Retention des häufig noch funktionalen Kanalproteins im Zellinneren und zu einer reduzierten Oberflächenexpression. Ziel dieses Projektes war daher die Identifizierung von chemischen und pharmakologischen Chaperonen, welche den trafficking-Defekt von CNGA3-Kanalmutanten korrigieren. Dazu wurde ein Aequorin-basierter Bioassay entwickelt, mit welchem im Zellkultursystem die Oberflächenexpression von CNG-Kanälen anhand des Liganden-vermittelten Calciumeinstroms quantifiziert werden kann. Für eines der neun getesteten chemischen Chaperone (dem L-Glutamin) sowie 33 der untersuchten 83 pharmakologischen Chaperone konnte nach Behandlung von CNG-Kanälen mit der Mutation p.E228K eine Erhöhung des Calciumeinstroms mit dem Bioassay detektiert werden. Das höchste Signal wurde nach Behandlung mit Nisoldipin erhalten, weitere besonders effektive pharmakologische Chaperone waren verschiedene Dihydropyridine, der epitheliale Natriumkanalantagonist Amilorid, der Natriumkanalantagonist Bupivacain sowie die Antagonisten des hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) Ionenkanals ZD7288 und Zatebradin. Anhand der Messergebnisse der Dihydropyridine konnten auch einige Aussagen über strukturelle Merkmale, welche für die Korrektur der mutanten CNG-Kanäle relevant sind, getroffen werden. Für die Substanzen Amilorid, Bupivacain, ZD7288, Zatebradin, Nisoldipin und JFD03311 konnte demonstriert werden, dass sie auch den trafficking-Defekt anderer CNG-Kanalmutanten (p.R283Q, p.T291R, p.S3419, p.E376K, p.R427C und p.R563C in CNGA3) verbessern können und dass, mit Ausnahme von ZD7288, die Substanzbehandlung per se die Zellviabilität nicht bzw. nur gering beeinträchtigt wird. In anschließenden Kontrollexperimenten wurde geklärt, ob die Testsubstanzen die Kanalfunktion beeinträchtigten oder die Expression des mutanten CNG-Kanals bzw. des Reporters Aequorin erhöhten, wodurch sich ebenfalls die mit dem Bioassay gemessenen Signalerhöhungen erklären ließen. Hierbei zeigte sich, dass einige Substanzen das Expressionslevel des Reporters Aequorin deutlich erhöhen konnten. Mit Ausnahme des Bupivacains konnte die Erhöhung des Aequorinlevels alleinig nicht die Signalerhöhung erklären, weshalb wir davon ausgehen, dass die mit dem Bioassay gemessenen Signalerhöhungen durch ein erhöhtes Aequorinlevel und eine Korrektur des trafficking-Defekts zu erklären sind. Die Effektivität einiger im Bioassay identifizierter Substanzen konnte durch Oberflächenbiotinylierung und anschießender proteinbiochemischer Analyse mittels Western Blot Experimenten bestätigt werden. Somit konnten mit dem hier etablierten Aequorin-basierten Bioassay erfolgreich chemische und pharmakologische Chaperone identifiziert werden, die das trafficking von mutanten Zapfen CNG-Kanälen verbessern und somit ein erster Schritt zur Entwicklung einer pharmakologischen Therapie für die Achromatopsie gemacht werden.

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