Natural killer cell transcriptome in patients treated with multi-drug-therapy and host genetic factors influencing leprosy outcome

Abstract

Leprosy is a bacterial disease of the skin and the nerves, caused by Mycobacterium leprae. Ever since the introduction of a multi-drug therapy in the 1970’s, worldwide incidence has been decreasing and the disease has been eradicated in many countries. However, in recent years occurrence of new cases remains stable at around 200,000 per year. Most new cases are reported in developing countries, and India accounts for more than half of new cases registered every year. In my thesis, I investigated how innate immunity plays an important role in regulating the disease outcome during multi-drug-therapy. This is addressed by examining the transcriptome profile of specific cells of the innate immunity, namely the Natural Killer (NK) cells. Secondly, I investigated innate immunity-associated genes of the human host that are believed to play a significant role in regulating the disease outcome. The thesis is structured into four different chapters. In chapter I of my thesis, published as an original study, I evaluated four specific functional variants in three different genes that are part of the NOD-2 signaling pathway: NOD2 (rs9302752A/G), LRRK2 (rs1873613A/G), and RIPK2 (rs40457A/G and rs42490G/A). I utilized 211 clinically classified Indian leprosy patients with 230 ethnically matched controls. The genetic variants were chosen for their role in innate immunity and because they had been found to be associated to leprosy in an earlier study carried out in a Han Chinese population. The LRRK2 locus proved to be associated with leprosy outcome. The LRRK2 rs1873613A minor allele and respective rs1873613AA genotype were significantly associated with an increased risk whereas the LRRK2 rs1873613G major allele and rs1873613GG genotypes conferred protection. Also, the reconstructed GA haplotype from the RIPK2 rs40457A/G and rs42490G/A variants was observed to contribute towards increased risk. In chapter II, also published as an original study, I investigated loci in the heterodimeric transporter associated with antigen processing (TAP) gene, which is known to play a vital role in immune surveillance. Functional variants both in TAP1 (rs1057141 Iso333Val and rs1135216 Asp637Gly) and TAP2 (rs2228396 Ala565Thr and rs241447 Ala665Thr) were genotyped using a study group of clinically classified Indian leprosy patients (n = 222) and ethnically matched controls (n = 223). The minor allele of TAP1 6 (637G) contributed to an increased risk of leprosy. In the dominant model, two of the researched genotypes of TAP1, rs1135216AG and rs1135216GG, contributed to an increased risk of leprosy as well. In the unpublished chapter III of my thesis, I investigated the interactions of M. leprae antigen with monocytes and monocyte-derived macrophages by fluorescenceactivated cell sorting. M. leprae whole cell antigen up-regulated L-Selectin expression in monocytes by 20%. This is a strong indicator of increased migration of phagocytic cells into the tissue upon identification of a threat by Mycobacterium leprae. Additionally, the CD163 expression is increased by 30% in macrophages. As CD163 is an indicator of M2-macrophage activity this underlines the role of possible immunoevasion by the pathogen through alternative activation of macrophages. In chapter IV, also unpublished, peripheral blood mononuclear cells were extracted from fresh blood of 9 Indian leprosy patients (5 paucibacillary and 4 multibacillary) and three healthy, ethnically matched controls. The cells were then incubated and afterwards mRNA was isolated from them. The Natural Killer-cell transcriptome profile was investigated using microarray technology. LCN2 and APOBEC3 transcription was predominantly up-regulated in paucibacillary cases, while multibacillary cases were mostly unchanged and controls were down-regulated. A comparison of paucibacillary and multibacillary patients with controls as a baseline revealed that multibacillary patients generally showed a higher transcription of genes associated to cell-cellcommunication, a phenomenon not repeated in paucibacillary patients, which actually presented a down-regulation in comparison with healthy controls. Further, multibacillary patients also showed an up-regulation in gene-products involved in immunity. However, some notable exceptions emerged, such as CD70 and TNFRSF9. In conclusion, utilizing a combination of molecular genetics, cell-culture experiments, and microarray technology, a number of promising findings can be presented here which could serve in deepening our understanding of host-bacterial interactions in leprosy.

Lepra ist eine bakterielle Erkrankung der Haut und Nerven, die von Mycobacterium leprae hervorgerufen wird. Seit Einführung einer Antibiotikatherapie in den siebziger Jahren ist die Anzahl an weltweit Infizierten stark gesunken und die Krankheit ist in vielen Ländern ausgerottet. In letzter Zeit verbleibt die Zahl an registrierten Neuerkrankungen jedoch konstant bei ca. 200.000 Personen pro Jahr. Von den Ländern, die noch immer unter der Lepra leiden, verzeichnet Indien mehr als die Hälfte der jährlichen Neuerkrankungen. Die Erforschung der Besonderheiten im Genom der indischen Bevölkerung, die dieses ermöglichen, sowie die generelle Untersuchung der komplizierten Interaktionen zwischen Erreger und Wirtsimmunität sind die Ziele der hier präsentierten Ergebnisse. In den Studien für Kapitel I verglichen wir 211 klinisch klassifizierte indische Leprapatienten mit 230 ethnisch entsprechenden Kontrollen. Die vier untersuchten genetischen Varianten waren: NOD2 (rs9302752A/G), LRRK2 (rs1873613A/G), und RIPK2 (rs40457A/G und rs42490G/A). Ihnen wurde bereits eine Assoziation mit Lepra in einer früheren Studie mit Han Chinesen nachgewiesen. Das rezessive Allel LRRK2 rs1873613A und der entsprechende Genotyp rs1873613AA waren signifikant mit einer erhöhten Infektionsgefahr assoziiert. Andererseits vermittelten das dominante Allel LRRK2 rs1873613G und der entsprechende Genotyp rs1873613GG in unserer Patientenkohorte einen Schutz gegen Lepra im Allgemeinen und gegen die pauzibazilläre Ausprägung im Besonderen. Zudem beobachteten wir, dass der GA Haplotyp der RIPK2 rs40457A/G und rs42490G/A Varianten mit einem erhöhten Risiko der Erkrankung einherging, während der AA Haplotyp einen Schutz vermittelte. Im Kapitel II wurden die möglichen Assoziationen von Polymorphismen in den Genen TAP1 und TAP2 zur Lepra in einer Kohorte von 222 klinisch klassifizierten indischen Leprapatienten untersucht und mit den Genotypen in 223 ethnisch entsprechen Kontrollen verglichen. Die Genotypisierung fand durch Sequenzierung in vier Loci statt: TAP1 (rs1057141 Iso333Val und rs1135216 Asp637Gly) und TAP2 (rs2228396 Ala565Thr und rs241447 Ala665Thr). Das rezessive Allel TAP1 637G trug zu einer erhöhten Anfälligkeit für Lepra bei. Im dominanten Model trug der Genotyp TAP1 8 rs1135216AG + GG zusätzlich zu einer Erhöhung der Erkrankungswahrscheinlichkeit bei. Im Kapitel III wurden periphere mononukleäre Blutzellen verwendet, um die Interaktion von M. leprae-Antigen mit Monozyten und mit aus Monozyten gewonnenen Makrophagen via „fluorescence-associated cell sorting“ zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass das verwendete Antigen die L-Selectin Expression in Monozyten um 20% erhöhte. Hier zeigt sich ein möglicher Hinweis darauf, dass die Migration von phagozytischen Zellen ins Gewebe von der Bedrohung durch Mycobacterium leprae gefördert wird. Zudem war die CD163 Expression in aktivierten Makrophagen um 30% höher. CD163 ist ein Indikator für M2-Makrophagenaktivität, daher ergeben sich aus dieser Tatsache weiterführende Fragestellungen über die Rolle von M. leprae in der alternativen Aktivierung von Makrophagen. Da alle Experimente mit einem Antigen ausgeführt wurden, das aus fragmentierten Bakterienzellen besteht, kann davon ausgegangen werden, dass die beobachteten Effekte passiver Natur sind. Für Kapitel IV wurden periphere mononukleäre Blutzellen von 9 indischen Leprapatienten (5 pauzibazillär und 4 multibazillär) und 3 ethnisch entsprechenden Kontrollen extrahiert. Die gewonnenen Zellen wurden inkubiert und anschließend deren mRNA isoliert. Hierüber wurde die genetische Aktivität durch Verwendung von „microarray“ Technologie bestimmt. Ein individueller Vergleich von Patienten und Kontrollen zeigte auf, dass LCN2 und APOBEC3 hauptsächlich in pauzibazillären Fällen hochreguliert wurden. Ein Vergleich der Patientengruppen enthüllte zudem, dass multibazilläre Patienten im Allgemeinen eine höhere Transkription von Genen zeigten, die mit interzellulärer Kommunikation assoziiert sind, wohingegen pauzibazilläre Patienten hier herunter regulierten. Außerdem präsentierten multibazilläre Patienten erhöhte Transkription von Genen, die in die Immunität involviert sind. Hier waren jedoch ein paar bemerkenswerte Ausnahmen festzustellen, wie zum Beispiel in den Fällen von CD70 und TNFRSF9. Abschließend lässt sich feststellen, dass diese Dissertation innovative Wege präsentiert, mit denen Lepra trotz der mit der Krankheit assoziierten Einschränkungen untersucht werden kann. Unter Verwendung einer Kombination von Methoden der molekularen Genetik, Zellkulturexperimenten, und „microarray“ Technologie war es uns möglich diverse interessante Entdeckungen zu machen, auf denen zukünftige Experimente fußen können.