Nitrate sensing and cell wall modification in Staphylococci

Abstract

This thesis highlights two topics concerning the regulation of energy metabolism and the cell wall biosynthesis in Staphylococci. Most members of this genus are facultative anaerobic microorganisms able to respire on nitrate as final electron acceptor. The completely apathogenic organism Staphylococcus carnosus is used as starter culture in food industry. Dissimilatory nitrate reduction causes desired effects during the ripening process of sausages. First, the nitrate concentration is reduced, and nitrite combines with myoglobin to nitrosomyoglobin to yield the appealing red color of sausages. Secondly, use of starter cultures in food production reduces likewise the risk of food poisoning and food spoilage. The signal transduction system that regulates the anaerobic respiration has to transduce two signals: The absence of oxygen and the presence of nitrate as the final electron acceptor. The two component system NreBC is composed of an oxygen-sensing histidine kinase with its cognate response regulator, which induces gene expression in the absence of oxygen. In Niemann et al we present two X-ray structures of NreA bound to its physiological ligand nitrate as well as to iodide in the binding pocket. Based on the X-ray structure, point mutations were introduced that diminish nitrate binding. The effects of the mutations were analyzed with isothermal titration calorimetry, CD-spectroscopy and in vivo lipase reporter gene assays. Thus, nitrate binding to NreA affecting the expression level of genes necessary for nitrate respiration could be described. The absence of oxygen activates kinase activity, which is further enhanced when nitrate-free NreA is present. In Nilkens et al we could describe how the nitrate status is introduced to the signal transduction pathway. NreA without bound nitrate acts as negative regulator on the NreB kinase activity. Since the extensive usage of antibiotics, the opportunistic pathogen S. aureus has been accumulating antibiotic resistance genes. Thus, the treatment of diseases caused by methicillin- or multi-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) has become even more challenging. S. aureus exhibits a cell wall feature making it resistant to lysozyme. In S. aureus the MurT/GatD enzyme complex amidates the isoglutamic acid at the second position of the stem peptide. The presence of isoglutamine at this position contributes to a higher degree of cross linkages in the cell wall and a higher growth rate. MurT/GatD is a cytosolic enzyme complex that amidates the cell wall precursor Lipid II. This reaction affects the viability of S.aureus and thus make MurT/GatD or Lipid II promising drug targets. In this thesis, I describe a purification protocol of the intact MurT/GatD complex that yields pure protein, which is suitable for X-ray crystallography.

Diese Doktorarbeit umfasst zwei Themen: die Regulierung des Energiestoffwechsels und die Zellwandbiosynthese bei Staphylokokken. Diese Gattung beherbergt viele fakultativ anaerobe Arten, die mit Nitrat als finalen Elektronenakzeptor atmen können. Staphylococcus carnosus ist völlig apathogen und wird als Starterkultur in der Lebensmittelindustrie eingesetzt. Dissimilatorische Nitratreduktion führt zu gewünschten Effekten während der Wurstreifung. Zum einen wird die Nitratkonzentration reduziert und Nitrit verbindet sich mit Myoglobin zu Nitrosomyoglobin, wodurch die gewünschte rote Farbe der Wurst entsteht. Zweitens reduziert die Verwendung von Starterkulturen in der Nahrungsmittelproduktion das Auftreten von Lebensmittelvergiftungen und Lebensmittelverderb. Anaerobe Atmung wird durch das Signaltransduktionssystem reguliert, welches zwei Reize vereint: Die Abwesenheit von Sauerstoff und die Anwesenheit von Nitrat als finalem Elektronenakzeptor. Das Zweikomponenten System NreBC ist aus einer sauerstoffabhängigen Histidinkinase und seinem dazugehörigen Response Regulator aufgebaut, der in Abwesenheit von Sauerstoff die Genexpression aktiviert. In Niemann et al. stellen wir zwei Kristallstrukturen von NreA vor: mit Nitrat als physiologischen Liganden, sowie mit gebundenen Iodid. Auf der Basis der Kristallstrukturen wurden Punktmutationen eingeführt, die die Nitratbindung verringert. Die Wirkungen der Mutationen wurden durch isotherme Titrationskalorimetrie, CD-Spektroskopie und in vivo Lipase Reportergen-Assays analysiert. Somit konnte der Einfluss von NreA abhängig von der Ligandenbindung beschrieben werden. Die Abwesenheit von Sauerstoff induziert die Kinaseaktivität, welche weiter verstärkt wird, wenn Nitrat an NreA gebunden hat. In Nilkens et al. konnte beschreiben werden, wie der Nitratstatus in den Signaltransduktionsweg integriert wird. NreA ohne gebundenes Nitrat wirkt als negativer Regulator auf die Kinaseaktivität von NreB. Seit dem umfangreichen Einsatz von Antibiotika weist das opportunistische Pathogen Staphylococcus aureus vermehrt Antibiotikaresistenzgene auf. Krankheiten, die durch Methicillin- oder multi-resistenten S. aureus (MRSA) verursacht werden, sind so noch schwieriger zu behandeln. S. aureus zeigt eine Zellwandbesonderheit auf, die ihn widerstandsfähig gegen Lysozym macht. In S. aureus amidiert der MurT/GatD Enzymkomplex die Isoglutaminsäure an der zweiten Position des Stammpeptids. Die Anwesenheit von Isoglutamin an dieser Stelle führt zu einer erhöhten Quervernetzung der Zellwand und zu höheren Wachstumsraten. MurT/GatD ist ein zytosolischer Komplex, der den Zellwandvorläufer Lipid II amidiert und einen starken Einfluss auf die Lebensfähigkeit von S. aureus hat. So erscheinen MurT/GatD oder Lipid II als vielversprechende Angriffspunkte für Medikamente. In dieser Arbeit wird ein Reinigungsprotokoll für den intakten Murt/GatD Komplex für die Röntgenkristallographie beschrieben.