Structural Analysis and Glycan Receptor Binding Specificities of Human Polyomaviruses

Abstract

This thesis investigates the atomic structures and cell surface glycan receptor specificities of six human polyomaviruses. In healthy individuals, polyomaviruses establish usually asymptomatic chronic infections, but they may cause severe disease in immunocompromised patients. High-resolution X-ray structures of the major capsid protein VP1 alone and in complex with its specific glycan receptors allowed to analyze the molecular basis for underlying recognition events during early steps of the infection. The findings from crystallographic studies were corroborated with cell-based binding experiments using flow cytometry, interaction studies in solution by NMR spectroscopy, and infection studies in cell culture. The presented results highlight the enormous complexity of virus-glycan interactions and demonstrate that subtle differences in both the viral attachment protein and the cell-surface glycan receptor modulate binding specificities and affinities and thus, are key determinants for tissue and host tropism, viral infectivity, and pathogenesis. JC Polyomavirus (JCPyV) causes the fatal demyelinating disease Progressive Multifocal Leukoencephalopathy (PML) in immunocompromised individuals. A brain isolate of JCPyV, a genotype 1 strain, requires α2,6-linked sialic acids on the LSTc glycan for attachment to host cells, whereas a kidney isolate, a genotype 3 strain, was reported to interact with gangliosides featuring α2,3- and α2,8-linked sialic acids. Comprehensive structural and functional analyses of these two representative strains and their glycan receptor specificities show that engagement of LSTc is a prerequisite for functional receptor engagement for all seven JCPyV genotypes while the weaker-binding gangliosides are not required for infection. Interestingly, the majority of JCPyV isolates from PML patients contain distinct mutations within or in proximity to the LSTc binding site on VP1. The presented results reveal that binding of these mutant viruses to glycans is abolished or severely compromised rendering them not infectious. Thus, these viruses likely utilize a so far unknown receptor for the infectious entry and/or play alternative roles in PML pathogenesis. In order to explore potential strategies for the development of antiviral compounds against PML a fragment-based screening approach was carried out and subsequent X-ray structure analysis identified a novel compound binding site inside the hydrophobic cavity of the JCPyV VP1 pentamer. Further studies show that modifications to the five-fold pore of the VP1 pentamer result in a severe reduction of infectivity, suggesting that the pore is an important structural feature of polyomaviruses. Thus, targeting this pore may be proven to be an effective antiviral therapy. Crystal structures of VP1 from Trichodysplasia spinulosa-associated Polyomavirus (TSPyV) in complex with three different glycans reveal a sialic acid binding site that is shifted by about 18 Å from the ‘classical’ sialic acid binding sites of JCPyV and other polyomaviruses. Functional and cell-based studies confirm the importance of these novel interactions with sialic acids and suggest that glycolipids play an important role during TSPyV infection. Surprisingly, this new sialic acid binding site is also conserved in VP1 of Human Polyomavirus 12 (HPyV12), whereas the human New Jersey Polyomavirus (NJPyV) employs a third location for the recognition of an Neu5Ac-α2,3-Gal-containing receptor. A structure-based phylogenetic analysis suggests that TSPyV, HPyV12, and NJPyV share their sialic acid binding site with closely related non-human polyomaviruses providing initial clues about determinants of host specificity and evolution of these viruses. In contrast, Human Polyomavirus 6 and 7 (HPyV6 and HPyV7, respectively) carry uniquely elongated loops that cover the bulk of the outer virion surfaces, and moreover, obstruct the groove that binds sialylated glycan receptors in related viruses. Consistently, cell attachment and NMR studies further suggest that sialylated glycans are not required for cell attachment of both, HPyV6 and HPyV7. In conclusion, with its relatively high sequence homology and a conserved overall architecture, the growing Polyomaviridae family forms an excellent platform to analyze principles and molecular determinants of receptor specificity and antigenicity as well as critical factors for viral pathogenesis. A detailed understanding of the underlying molecular principles is important to establish a comprehensive toolbox, which can be used for new approaches for antiviral therapies and for the design of therapeutic gene vectors.

Diese Dissertation untersucht die atomaren Strukturen von sechs menschlichen Polyomaviren und das spezifische Andocken dieser Viren an Zuckerstrukturen auf Zelloberflächen der Wirtszellen. Bei gesunden Menschen verursachen Polyomaviren meist chronische asymptomatische Infektionen, jedoch können einige dieser Viren bei immungeschwächten Patienten schwere Erkrankung auslösen. Mit Hilfe von Röntgenstrukturen der Kapsidproteine in Komplexen mit Zuckerverbindungen konnten die molekularen Grundlagen für das spezifische Andocken dieser Viren an Zellen identifiziert werden. Anschließend wurden die Erkenntnisse aus den kristallographischen Studien mit zellbasierten Bindungsexperimenten mittels Durchflusszytometrie, Interaktionsstudien mittels NMR-Spektroskopie in Lösung und Infektionsstudien in Zellkultur überprüft und weiter analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse unterstreichen die enorme Komplexität von Interaktionen zwischen Viren und Zuckerstrukturen auf der Zelloberfläche und zeigen, dass feine Unterschiede in den viralen Proteine oder den gebundenen Zuckermolekülen eine wichtige Rolle für die Erkennungsprozess und die Bindungsaffinität spielen. Diese spezifischen und gut regulierten Wechselwirkungen zwischen Virus und Rezeptoren auf der Wirtszelle sind nicht nur für die initiale Erkennung wichtig sondern auch die viralen Infektiosität und Pathogenese. JC Polyomavirus (JCPyV) kann bei immungeschwächten Personen die tödliche Gehirnerkrankung Progressive Multifokale Leukoenzephalopathie (PML) auslösen. Ein JCPyV Stamm aus dem Gehirn bindet an α2,6-verknüpfte Sialinsäure der linearen Zuckerstruktur LSTc auf der Wirtszelle, während Untersuchungen für einen anderen JCPyV Stamm, der aus der Niere isoliert wurde, zeigten, dass auch Gangliosiden mit α2,3- oder α2,8- verknüpfter Sialinsäure gebunden werden. Eine umfassende strukturelle und funktionelle Analyse der zwei repräsentative Virusstämme zeigt hier jedoch deutlich, dass die Bindung an LSTc eine Voraussetzung für die Infektion für alle sieben JCPyV Genotypen ist, während die schwächer gebundenen Ganglioside nicht für die Infektion erforderlich sind. Interessanterweise besitzen JCPyV Isolate von PML-Patienten oft eine kleine Anzahl von konservierten Mutationen innerhalb oder in unmittelbarer Nähe der LSTc-Bindungsstelle auf dem Kapsidprotein. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass die Bindung an Zuckerstrukturen durch die Veränderungen in VP1 verhindert oder stark beeinträchtigt ist und daher diesen Viren nicht mehr infektiös sind. Somit verwenden diese PML-assoziierten Viren wahrscheinlich ein bisher unbekanntes Molekül auf der Zelloberfläche für den infektiösen Eintritt und/oder sie tragen in einer anderen Weise zur PML-Pathogenese bei. Ein Fragment-basiertes Screening wurde durchgeführt um mögliche Strategien für die Entwicklung von antiviralen Verbindungen gegen PML zu testen. Die Bindung von einem Fragment im Innenraum des hydrophoben VP1 Pentamers wurde mittels Strukturanalyse bestätigt. Zusätzlich konnte in einer Untersuchung gezeigt werden, dass Änderungen der fünffachen Pore der VP1-Pentamere die Virusinfektion verringern. Diese Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die Poren ein wichtiger struktureller Bestandteil des Viruskapsids ist. Somit stellt auch die Pore oder gar der hydrophobe Innenraum des VP1 Pentamers einen möglichen Angriffsort für die Entwicklung von wirksamen antiviralen Therapien dar. Kristallstrukturen von VP1 des Trichodysplasia spinulosa-assoziierten Polyomavirus (TSPyV) im Komplex mit drei verschiedenen Zuckermolekülem zeigen eine Sialinsäure-Bindungsstelle, die um etwa 18 Å von der "klassischen" Sialinsäure-Bindungsstellen von JCPyV und anderer Polyomaviren entfernt ist. Funktionelle Untersuchungen bestätigen die Wichtigkeit dieser neuartigen Sialinsäure-Interaktion für die TSPyV Infektion und lassen zudem vermuten, dass besonders Glycolipide hierbei eine wichtige Rolle einnehmen. Diese neue Bindungsstelle ist auch im Kapsid des menschlichen Polyomavirus 12 (HPyV12) strukturell konserviert, während der menschliche New Jersey Polyomavirus (NJPyV) in einem dritten Bereich von VP1 mit einer spezifischer Zuckerstruktur wechselwirkt. Strukturbasierte phylogenetische Analysen zeigen, dass die Sialinsäure-Bindungsstellen von TSPyV, HPyV12 und NJPyV vermutlich auch in verwandten aber nicht-menschlichen Polyomaviren vorhanden sind und geben Hinweise über Determinanten der Wirtsspezifität und Evolution dieser Viren. Die humanen Polyomaviren 6 und 7 (HPyV6 und HPyV7) besitzen im Gegensatz dazu verlängerte VP1-Schleifenstrukturen, die den Großteil der Kapsidoberflächen abdecken und das Erkennen von Zuckermolekülen verhindert. Zusätzlich zeigen NMR-spektroskopische Untersuchungen, dass sialylierte Zucker nicht für das initiale Andocken von HPyV6 und HPyV7 an Zellen erforderlich sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, das die wachsende Familie der Polyomaviren mit einer hohen Sequenzhomologie und konservierten Gesamtarchitektur eine hervorragende Plattform bildet, um Einblicke in grundlegende Prinzipien und molekularen Determinanten für Rezeptorspezifität, viraler Antigenität und Pathogenese zu erhalten. Ein detailliertes Verständnis der molekularen Grundlagen ist wichtig für neue Ansätze in der Entwicklung von antiviralen Therapien und auch therapeutische Genvektoren.