Die Deubiquitinase USP9X stabilisiert das antiapoptotische Protein Mcl-1 in Prostatakarzinomzellen und vermittelt Strahlenresistenz

Abstract

Hintergrund: Antiapoptotische Bcl-2-Proteine sind bedeutend in der Tumorentstehung und in der Entwicklung von Therapieresistenzen. Das antiapoptotische Mcl-1 spielt in vielen Tumoren eine wichtige Rolle dabei [Skvara et al., 2005]. Die Regulierung des Mcl-1-Levels durch proteasomale Degradierung ist bedeutend für dessen schnellen Umsatz. Mcl-1 ist im Vergleich zu den anderen antiapoptotischen Bcl-2-Proteinen ein kurzlebiges Protein, dessen Level nach Hemmung der Translation schnell abnimmt [Quinn et al., 2011]. Weitere Studien verdeutlichten, dass Mcl-1 durch die Deubiquitinase USP9X, die den proteasomalen Abbau des antiapoptotischen Proteins verhindert, stabilisiert wird. In diesen Studien bewirkte das Herunterregulieren von USP9X vermehrten Zelltod [Schwickart et al., 2010; Trivigno et al., 2012]. Ein möglicher Zusammenhang zwischen der Stabilisierung von Mcl-1 durch die Deubiquitinase USP9X sollte nun auch in Prostatazellen untersucht werden.

Methoden: In den zwei etablierten Prostatazelllinien LNCaP und PC3 wurden die Level verschiedener Proteine der Bcl-2-Familie und der Deubiquitinase USP9X mittels Western Blot untersucht. Ebenfalls mittels Western Blot wurde die Aktivierung der Caspasen nach Bestrahlung gemessen. Die Initiierung der Apoptose nach Bestrahlung wurde anhand der durchflusszytometrischen Messung des mitochondrialen Membranpotentials mittels TMRE-Färbung und der Fragmentierung der DNA mittels Propidiumiodidfärbung nach Nicolettimethode analysiert. Eine Messung des klonogenen Überlebens erfolgte mittels Klonogenitätstest. Durch Lipofektion von siRNA wurde die Aktivität der Deubiquitinase USP9X herunterreguliert. Schließlich erfolgte per Western Blot die Messung der Mcl-1- und USP9X-Abundanzen auch in Patientengewebeproben der Prostata unterschiedlicher Malignität.

Ergebnisse und Diskussion: In den LNCaP- und PC3-Zellen zeigte sich in der durchflusszytometrischen Untersuchung nur ein geringer Anteil an Zellen mit zusammengebrochenem mitochondrialen Membranpotential sowie an Zellen mit fragmentierter DNA. Bei den LNCaP-Zellen wurde keine, bei den PC3-Zellen nur eine geringe Caspasenaktivierung nach Bestrahlung beobachtet. Auch im Klonogenitätstest zeigten die Zelllinien ein radioresistentes Verhalten. Die Messung der Mengen pro- und antiapoptotischer Bcl-2-Proteine ergab Unterschiede in der Stabilität des antiapoptotischen Bcl-2-Proteins Mcl-1, welches in den LNCaP-Zellen stabil nach Bestrahlung war hingegen in den PC3-Zellen abnahm. Gleichzeitig zeigte sich in den PC3-Zellen eine Heraufregulierung des proapoptotischen BH3-only Proteins Noxa. Die Menge der Deubiquitinase USP9X war in beiden Zelllinien nach Bestrahlung stabil. Durch die Herunterregulierung von USP9X kam es in beiden Zelllinien zu einer Reduktion der Mcl-1-Menge und zu einem signifikanten Anstieg der Zellen mit zusammengebrochenem mitochondrialen Membranpotential bzw. der Zellen mit fragmentierter DNA. Ebenso erniedrigten sich die Überlebensfraktionen der Zellen im Klonogenitätstest signifikant. Dieser Effekt fiel in den LNCaP-Zellen schon ab geringeren Bestrahlungsdosen auf. Schließlich zeigte sich für die Mcl-1-Proteinmenge in Patientenproben der Prostata eine angedeutete Korrelation erhöhter Werte mit ansteigender Malignität des Gewebes. Dies konnte für USP9X nicht beobachtet werden. Zusammenfassend zeigten unsere Ergebnisse eine Radiosensibilisierung der Prostatazelllinien LNCaP und PC3 durch Herunterregulierung von USP9X. In den LNCaP-Zellen kam es durch die USP9X-Herunterregulierung zu einer Destabilisierung der Mcl-1-Menge. Die PC3-Zellen zeigten auch bei nicht veränderter USP9X-Aktivität abnehmende Mcl-1-Mengen nach Bestrahlung. Möglicherweise werden durch die Herunterregulierung der Deubiquitinase in diesen Zellen andere Substrate beeinflusst. Auch der Einfluss des BH3-only-Proteins Noxa könnte in den PC3-Zellen Einfluss auf die Mcl-1-Stabilität haben.