Kinetische Analyse von Peptidarrays mittels bildgebender Reflektometrischer Interferenzspektroskopie

Abstract

In vielen biochemischen und medizinischen Fragestellungen spielt die Untersuchung biomolekularer Wechselwirkungen eine große Rolle. Die Arraytechnologie erlaubt die parallele Analyse tausender Bindungsereignisse im zeitsparenden Hochdurchsatzverfahren. Die Miniaturisierung ermöglicht zudem den Verbrauch von Reagenzien zu reduzieren und Kosten zu sparen. Seit Mitte der 1980iger Jahre wurden DNA-Microarrays zu einem wichtigen Werkzeug der Genomforschung. Schnell haben sich aber auch Protein- und Peptidarrays zur Untersuchung von Protein- und Peptidinteraktionen entwickelt. Peptidarrays haben ein weites Anwendungsfeld in der Immundiagnostik. Sie werden zum Beispiel in zur Analyse von Epitopsignaturen von Antikörpern, sowie in der Diagnose und Erforschung von Autoimmunkrankheiten eingesetzt. Kombiniert man die Arraytechnologie mit einer markierungsfrei arbeitenden und zeitaufgelösten Messmethoden, können nicht nur die Affinitätskonstanten einer Wechselwirkung, sondern auch die kinetischen Ratenkonstanten analysiert werden. Gerade im Bereich der Rezeptor-Ligand, Antiköper-Antigen Wechselwirkung ist die Kenntnis der kinetischen Parameter interessant. Sie führen zu einer genaueren Kenntnis der Bindungsmechanismen und können hilfreich sein, wenn gezielt Interaktionen zwischen zwei Molekülen beeinflusst werden sollen.

Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Systems zur kinetischen Analyse verschiedener Peptid-Antikörperinteraktionen mittels bildgebender Reflektometrischer Interferenzspektrsoskopie (iRIfS). Als primäre Interaktionspartner wurden Peptide aus dem Enzym Gewebstransglutaminase und ein monoklonaler Anti-Transglutaminaseantikörper gewählt. Zur Herstellung des Arrays wurde eine zur Immobilisierung der Peptide geeignete Oberflächenchemie ausgewählt und die optimalen Spottingbedingungen zur ortsaufgelösten Immobilisierung der Peptide ermittelt. Im Nachfolgenden wurde das System in Bezug auf Reproduzierbarkeit und Spezifität charakterisiert und die optimalen Bedingungen zur kinetischen Analyse der Peptid-Antikörper Wechselwirkungen untersucht. Mit diesen Bedingungen wurden dann verschiedene kinetische Analysen durchgeführt und verschiedene Auswertestrategien für kinetische Konstanten verglichen. Es wurde eine Software zur halbautomatisierten Auswertung kinetischer Arrays entwickelt, mit welcher es möglich ist, den optimalen Fitbereich zur kinetischen Analyse festzulegen. Die Leistungsfähigkeit des iRIfS-Systems und der Software wurde an einem weiteren Peptid-Antikörperinteraktionssystems untersucht. Für das FLAG-Epitop wurde an verschiedenen Positionen der Sequenz ein Austausch der Aminosäuren durchgeführt. Dabei wurde die ursprüngliche Aminosäure gegen jede andere proteinogene Aminosäure ausgetauscht und der Einfluss der einzelnen Veränderungen auf die kinetischen und thermodynamischen Konstanten untersucht.