Identifikation und Charakterisierung neuer Virulenzfaktoren von Staphylococcus aureus: Heparansulfat-bindende Proteine und WTA-abhängige Methicillin-Resistenz

Abstract

Die vorliegende Dissertationsschrift umfasste zwei Teilprojekte auf dem Gebiet der Pathogenese und β-Laktam-Resistenz von S. aureus. Der erste Teil beschäftigte sich mit der Heparansulfatbindung der Proteine Eap und IsaB. Der zweite Teil ging der Frage nach, ob die Glykosylierung der Wandteichonsäure Einfluss auf die β-Laktam-Resistenz des HA-MRSA-Stammes S. aureus COL hat.

Der erste Teil der Promotionsarbeit diente der Identifikation zweier neuer Heparansulfat-bindender Proteine von S. aureus. Vorarbeiten zu diesem Thema bestätigten die Relevanz der Interaktion mit Heparansulfaten für die Pathogenese und Internalisation von S. aureus. Ebenso war bekannt, dass S. aureus mehrere Proteine besitzt, die Heparansulfate binden können. Dem Studiendesign folgend wurden zunächst in Frage kommende Proteine eingegrenzt. Die Auswahl umfasste das sekretierte, multifunktionale extracellular adherence protein (Eap) und das membranständige immunodominant surface antigen B (IsaB). Die Arbeitshypothese ging davon aus, dass Eap und IsaB in der Lage seien, Heparansulfate zu binden. Die Gene, die für Eap und IsaB codieren, wurden in den Überexpressionsvektor pET28a kloniert. Nach der erfolgreichen Überexpression von Eap und IsaB in E. coli C43 wurden diese auf ihre Löslichkeit untersucht und mittels eines eigens zu diesem Zweck etablierten Heparansulfat-Pull-Down-Assays auf ihre Fähigkeit zur Heparansulfatbindung untersucht. In diesem Assay wurden die überexprimierten Proteine mit Heparin-beschichteten Sepharosebeads vermengt. Nach mehreren Waschschritten wurde die Bindung zwischen Protein und Heparin thermisch unterbrochen und gebundene Proteine gingen wieder in Lösung über. Alle Nachweise wurden mittels SDS-PAGE und Western Blot erbracht. Es wurde gezeigt, dass Eap und IsaB Heparansulfate binden können, die Arbeitshypothese wurde bestätigt. Dies identifiziert erstmals zwei Heparansulfat-bindende Proteine dieses Bakteriums. Die Relevanz der Ergebnisse für Adhäsion, Pathogenese und Evasionsmechanismen von S. aureus verbleibt zunächst unklar. Jedoch ermöglichen die Erkenntnisse dieser Arbeit die Entwicklung neuer Adhäsions- und Interaktionsmodelle und erweitern das Bild der Einflussmöglichkeiten von S. aureus auf den Wirtsorganismus immens.

Im zweiten Teil dieser Promotionsarbeit wurde die Hypothese verfolgt, dass die Glykosylierung der Wandteichonsäuren keinen Einfluss auf die β-Laktam-Resistenz des hospital acquired MRSA-Stammes S. aureus COL hat. Die Glykosylierung der Wandteichonsäuren erfolgt intrazellulär durch die Glycosyltransferasen TarM und TarS. TarM überträgt dabei α-, TarS βGlcNAc-auf die Wandteichonsäure. Die entsprechenden Gene wurden in dem zu untersuchenden Stamm mittels homologer Rekombination gezielt inaktiviert, um zwei Knockout-Mutanten zu schaffen. Die Kontrolle des korrekten Knockouts wurde mittels Colony-PCR durchgeführt. Es wurde die minimale inhibitorische Konzentration von Oxacillin auf das Wachstum der Mutanten in Flüssigkultur bestimmt. Es zeigte sich hierbei kein Unterschied zum Wildtyp. Die Negativkontrolle zeigte kein Wachstum. Die Studie zeigt, dass der Verlust α- bzw. β-glykosylierter Wandteichonsäuren keinen Einfluss auf das Resistenzniveau von S. aureus COL gegenüber Oxacillin hat. Für den community acquired MRSA-Stamm MW2 ist bekannt, dass ebendieser Verlust die Resistenz gegenüber Oxacillin herabsetzt. Die Studie zeigt, dass der Einfluss glykosylierter Wandteichonsäure auf die Oxacillinresistenz zumindest stammspezifisch ist. Der exakte Mechanismus hierbei verbleibt unbekannt. Die Interaktion der penicillin binding proteins 2a und 4 mit der Wandteichonsäure und das teichonsäureabhängige Ladungsniveau der Zellwand stellen nur zwei der möglichen Ursachen für diesen Effekt dar. Es wird darüber hinaus deutlich, dass Stämme, die vor allem in Einrichtungen des Gesundheitssystems vorkommen, offenbar ein komplexeres System der Resistenzentwicklung besitzen als Stämme, die außerhalb des klinischen Sektors erworben werden.