Characterization of Draxin as a potential secreted Netrin-1 modulator in vertebrate neural development

Abstract

Axon guidance cues are crucial signals for neurons to build complex networks during early developmental stages. Netrin is one of the main guidance cues that in most cases attracts neurons to their destinations. Distinct Netrins and Netrin receptors have been identified to carry out the guidance function. However, no direct Netrin modulator has been described yet. In this study, we used AVEXIS (Avidity based Extracellular Interaction Screen), a large-scale protein-protein interaction screen assay, to identify novel binding partners for Netrin proteins, and zebrafish as model organism to study the function of the newly identified interactions.

We found Draxin, a secreted axon guidance protein, to directly interact with Netrin. The novel interaction is conserved for the orthologous human proteins. Furthermore, Draxin is able to outcompete Netrin receptors for Netrin-1 binding in a biochemical competition assay. The binding of Netrin receptors to Netrin-1 is reduced or even abolished in the presence of Draxin, indicating an inhibitory function of Draxin by breaking the communication between Netrin and its receptors. By generating Netrin truncations, I narrowed down the interaction interface to the third EGF domain of Netrin-1, the domain described to be necessary for Netrin-Netrin receptor interactions. I further narrowed down the interaction interface to a highly conserved 22 amino acid fragment within Draxin. This Draxin 22 amino acid fragment is sufficient for binding to Netrin-1 and the protein sequence is conserved across vertebrate species including chick, mouse and human. Furthermore, the 22 amino acid peptide fused to the Fc protein (the constant region of an immunoglobulin molecule) is able to outcompete Netrin receptors for Netrin binding.

Expression analysis in zebrafish embryos shows that both draxin and netrin mRNAs are expressed in the neural tube. They are co-expressed in regions surrounding the forebrain commissures. In the spinal cord, draxin is mainly expressed dorsally whereas netrin is located ventrally. Since both Draxin and Netrin are secreted proteins and have been reported to act as long-range guidance cues, the expression patterns suggests that reciprocal gradients of active Draxin and Netrin proteins can form along the dorsal-ventral axis of the developing spinal cord to regulate the correct formation of spinal cord commissures. Two independent embryonic binding assays revealed that Draxin and Netrin are able to interact in zebrafish embryos.

Thus, we propose a model in which Draxin functions as a secreted Netrin signaling modulator influencing vertebrate axon pathfinding. Draxin might shape the functional extracellular Netrin gradient by sequestering Netrin proteins. Since human Netrin-1 serves as a survival factor for specific tumors, Draxin—or the Netrin binding fragment of Draxin—could be potentially used to activate cell death in human cancer cells.

Axonale Lenkungsmoleküle (engl.:Axon guidance cues) sind wichtige Signalstoffe, ohne die Nervenzellen während der frühen Embryonalentwicklung keine komplexen Netzwerke etablieren könnten. Netrin ist eines dieser wichtigen Signalproteine und lockt/zieht Axone allermeistens hin zu ihren Zielgebieten. Verschiedene Netrine und Netrin-Rezeptoren wurden in unterschiedlichen Geweben beschrieben. Komponenten, die direkt im extrazellulären Bereich auf Netrin wirken sind bisher unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde ein sogenannter ‚Avidity based Extracellular interaction Screen’ (AVEXIS: Protein-Protein-Interaktionsscreen) benutzt, um neue Partner für Netrin-Proteine zu identifizieren. Die neu gefundenen Interaktionspartner wurden im Zebrafisch auf ihre in vivo Funktionen hin untersucht.

Wir identifizierten Draxin, ein sezerniertes Protein, das an der Axonführung beteiligt ist, als direkten Bindungspartner von Netrin. Diese, bislang noch nicht beschriebene Interaktion, kann auch für die menschlichen Orthologe nachgewiesen werden. Im biochemischen Kompetitions-Assay hemmt Draxin die Bindung von Netrin-1 an den entsprechenden Rezeptor. Dabei wird die Bindung von Netrin-1 an den Rezeptor stark abgeschwächt oder gänzlich aufgehoben. Indem das Protein die Kommunikation zwischen Netrinen und den entsprechenden Rezeptoren hemmt kann Draxin eine inhibitorische Funktion zugeschrieben werden. Durch gezielte Verkürzungen des Proteins konnte ich zeigen, dass die Interaktion mit Draxin über die dritte EGF-Domäne von Netrin-1 stattfindet. Diese Domäne ist ebenfalls für die Interaktion mit dem Netrin-Rezeptor notwendig. Ich identifizierte außerdem ein hoch-konserviertes 22 Aminosäuren umfassendes Peptid in Draxin, das an der Interaktion mit Netrin beteiligt ist. Dieses Peptid ist ausreichend für eine Bindung an Netrin-1 und die Aminosäuresequenz ist hochkonserviert innerhalb der Wirbeltiere, einschließlich Huhn, Maus und Mensch. Zudem kann dieses Peptid, als Fusion mit dem Fc Protein (der konstanten Region eines Antikörpermoleküls), die Bindung von Netrin an den Rezeptor hemmen.

Eine Expressionsanalyse in Zebrafischembryonen zeigt sowohl netrin als auch draxin mRNAs werden im Neuralrohr exprimiert. In den Arealen nahe der Vorderhirn-Kommissur sind beide Gene ko-exprimiert, wohingegen im Rückenmark draxin hauptsächlich dorsal lokalisiert, netrin hingegen ventral. Sowohl Netrin als auch Draxin werden sezerniert, und beide Proteine sind über längere Distanzen hinweg als Signalmoleküle aktiv. Somit legen die Expressionsmuster nahe, dass die aktiven Proteine möglicherweise reziproke Gradienten entlang der dorso-ventralen Achse des sich entwickelnden Rückenmarks bilden, anhand derer die richtige Bildung der Kommissuren reguliert wird. In zwei unabhängigen Tests wurde gezeigt, dass Draxin und Netrin in vivo in Zebrafisch-Embryonen miteinander interagieren können.

Wir schlagen ein Modell vor, bei dem Draxin als sezernierter Modulator die Funktion von Netrin bei der Steuerung der axonalen Zielfindung beeinflusst indem es extrazelluläres Netrin komplexiert, seine Bindung an den Rezeptor verhindert und so die Form des aktiven Netrin-Gradienten negativ verändert. Da Netrin-1 bei bestimmten menschlichen Tumoren als Überlebenssignal dient könnte Draxin– oder das identifizierte Fragment, das an Netrin bindet – eine Möglichkeit bieten Zelltod in menschlichen Tumorzellen auszulösen.