Untersuchungen zur Charakterisierung des gegen Hepatitis A-Virus gerichteten monoklonalen IgM-Antikörpers 4E1

Abstract

Die hohe Kontagiosität und jährlich Millionen Fälle von Neuerkrankungen von Hepatitis A durch Infektionen mit HAV demonstrieren auch nach der Entwicklung eines gut wirksamen Impfstoffes Ende der 1980er Jahre die gesundheitsökonomische Relevanz der Erkrankung. Das Ziel dieser Arbeit richtete sich auf die Charakterisierung des monoklonalen gegen Hepatitis A-Virus gerichteten Antikörpers IgM 4E1 in der Labordiagnostik. In dieser Arbeit wurden zwei Methoden entwickelt, um den im Hybridoma-Expressmedium produzierten monoklonalen Antikörper (MAK) IgM 4E1 hoch zu reinigen. Dies gelang mit Hilfe der Größenausschluss-Chromatographie (SEC) und der Thiophilen Adsorptions-Chromatographie (TAC). Der Reinheitsgrad wurde mit Hilfe von SDS-PAGE mit anschließender Silberfärbung sowie Bestimmung der Proteinkonzentration durch BCA- und Bradford Protein Assay bestimmt. Beim Vergleich der Methoden zur Bestimmung der Proteinkonzentration sowohl im Zellkulturüberstand als auch in den Elutionsfraktionen der SEC und TAC zeigte sich, dass der BCA Protein Assay dem Bradford Protein Assay aufgrund eines größeren Arbeitsbereiches, höherer Sensitivität und besserer Reproduzierbarkeit überlegen ist. Die Verwendbarkeit des MAK IgM 4E1 in der Hepatitis A-Diagnostik wurde durch die Herstellung eines IgM-basierten HAV-Antigen-Sandwich-ELISA charakterisiert, in dem der MAK IgM 4E1 als Primärantikörper verwendet wurde. Dieser wurde mit dem MAK IgG 7E7-basierten HAV-Antigen-Sandwich-ELISA verglichen. Die Fragestellung bei diesem Vergleich richtete sich nach dem Bindungsverhalten des IgM 4E1 in seiner Verwendung als Primärantikörper. Dabei sollte untersucht werden, ob der IgM 4E1 als Pentamer-Antikörper mit fünffach mehr Bindungsstellen als der IgG 7E7 als Monomer-Antikörper in der Lage ist, eine größere Menge Antigen binden zu können. Es zeigte sich, dass der IgM 4E1-basierte ELISA in der Lage war, höhere Titerwerte zu bestimmen, was für die Annahme der höheren Bindungsfähigkeit spricht. Der über die jeweils 22 Versuche bestimmte gemittelte Titerwert der beiden ELISAs unterschied sich lediglich marginal, jedoch wies der IgM 4E1-basierte ELISA größere Schwankungen in der Bestimmung des Titerwertes auf, als der IgG 7E7-basierte ELISA. Darüber hinaus wurde der MAK IgM 4E1 mittels der auf FITC-Markierung basierender Immunofluoreszenz im Fluoreszenzmikroskop optisch dargestellt.