Das GTPase-aktivierende Protein Oligophrenin-1 und seine Rolle in der Thrombozytenfunktion

Abstract

Thrombozyten spielen eine wesentliche Rolle in der Hämostase, indem sie bei Verletzungen der Gefäßwand an diese adhärieren und durch Aggregatbildung zum Wundverschluss beitragen. Thrombozyten sind aber auch an der Pathogenese von akuten ischämischen Ereignissen wie Herzinfarkt oder Schlaganfall beteiligt. Der gegenwärtige Einsatz antithrombotischer Substanzen verhindert die ungewollte Thrombusbildung, ist jedoch limitiert durch ein erhöhtes Blutungsrisiko. Die Entwicklung neuer antithrombotischer Medikamente mit einer größeren therapeutischen Sicherheit setzt eine genauere Kenntnis der molekularen Mechanismen der Thrombozytenfunktion voraus. Mit diesem Ziel wurde in der vorliegenden Arbeit das RhoGAP-Protein Oligophrenin-1 (OPHN1) und seine Rolle in der Thrombozytenfunktion untersucht. RhoGAPs (GTPase-activating proteins) stimulieren die Hydrolyse von GTP zu GDP der Rho-GTPasen und inhibieren sie dadurch. In Thrombozyten sind die Rho-GTPasen RhoA, Cdc42 und Rac1 an den Umbildungsprozessen des Zytoskeletts während der Aktivierung beteiligt, indem sie u.a. die Aktinpolymerisierung und die Bildung von Zellausläufern beeinflussen. Wenig ist darüber bekannt, wie diese Rho-GTPasen in Thrombozyten reguliert werden. Auch die Funktion von OPHN1 in Thrombozyten ist noch unklar.

Mithilfe von OPHN1-defizienten Mäusen konnte hier gezeigt werden, dass das Fehlen von OPHN1 zu einer drastisch gesteigerten Aktivität der Rho-GTPasen RhoA, Cdc42 und Rac1 in ruhenden als auch in aktivierten Thrombozyten führt. OPHN1 ist demnach ein negativer Regulator dieser drei Rho-GTPasen in Thrombozyten. Die beobachtete veränderte Zytoskelettdynamik in Form einer gesteigerten Adhäsion und einer ausgeprägten Lamellipodienbildung der ophn1-/--Thrombozyten bei Spreading-Experimenten auf Fibrinogen lässt sich durch die hohe Aktivität der Rho-GTPasen erklären. Dabei deutet die verstärkte Lamellipodienbildung darauf hin, dass OPHN1 insbesondere die Aktivität von Rac1 beeinflusst. Das Fehlen von OPHN1 bewirkte außerdem eine verstärkte Aktivierungsreaktion der Thrombozyten, die sich durch eine gesteigerte Sekretion der alpha- und elektronendichten Granula sowie durch eine erhöhte Fibrinogen-Bindung von Integrin αIIbβ3 äußerte. Besonders stark reagierten die ophn1-/--Thrombozyten auf eine Stimulation des Rezeptors GPVI. Dies lässt darauf schließen, dass OPHN1 in die GPVI-vermittelte Signaltransduktion eingreift. Diese These wurde durch die verstärkte Phosphorylierung von PLCγ2, einer finalen Reaktion im GPVI-Signalweg, in den OPHN1-defizienten Thrombozyten unterstützt. Der aktivatorische Effekt durch OPHN1-Defizienz manifestierte sich auch in einer verstärkten Thrombusbildung unter niedrigen Scherraten sowie in vivo in einer verkürzten Blutungszeit der ophn1-/--Mäuse. Diese Ergebnisse belegen, dass OPHN1 ein wesentlicher Faktor bei der zytoskeletalen Reorganisation und bei der Aktivierung in murinen Thrombozyten ist.

Um weiterhin die Regulierung von OPHN1 selbst zu klären, wurde die Tyrosinphosphorylierung als potentieller Aktivierungsmechanismus von OPHN1 sowie die Proteinkinase Src als möglicher Regulator untersucht. Dabei ergab sich, dass im Laufe einer Aktivierung der Phosphorylierungsgrad von OPHN1 in murinen Thrombozyten ansteigt. Gleichzeitig nahm die Interaktion zwischen OPHN1 und Src zu. In Überexpressionsstudien mit A5-CHO-Zellen konnte eine Src-vermittelte Phosphorylierung von OPHN1 bestätigt werden. Diese Befunde weisen darauf hin, dass die Aktivierung von Thrombozyten zu einer Src-vermittelten Phosphorylierung von OPHN1 führt. Mithilfe von OPHN1-Mutanten, bei denen die Tyrosinphosphorylierungsstellen entfernt worden waren, konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung hauptsächlich am Tyrosin 370 zwischen der PH- und der GAP-Domäne stattfindet. WT-OPHN1 verursachte nach der Transfektion in A5-CHO-Zellen einen Adhäsionsdefekt sowie eine reduzierte Pseudopodienbildung. Diese Effekte traten bei der OPHN1-Mutante Y370A, die nicht an Tyrosin 370 phosphoryliert werden kann, in verminderter Form oder gar nicht auf. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Phosphorylierung ein regulierender Faktor für die Aktivität des RhoGAP-Proteins OPHN1 ist.