Charakterisierung von Virus-spezifischen T-Zellen gegen CMV, EBV und AdV nach GMP-konformer, simultaner Isolierung für die adoptive Immuntherapie

Abstract

Die Therapie viraler Infektionen nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSZT) stellt aufgrund der Toxizität und limitierten Wirksamkeit der zur Verfügung stehenden Virostatika nach wie vor eine große Herausforderung dar. Als attraktive Behandlungsoption bietet sich hier die Immuntherapie in Form eines adoptiven T-Zelltransfers an. Die bislang für eine klinische Anwendung zur Verfügung stehenden Protokolle dienen jedoch entweder nur der Isolation Antigen-spezifischer T-Zellen gegen einzelne Viren oder sind sehr zeitaufwendig. Der Fokus der aktuellen Forschung liegt daher auf der Entwicklung zeitsparender Protokolle und der simultanen Isolierung von Antigen-spezifischen T-Zellen gegen mehrere Viren für einen prophylaktischen Einsatz sowie zur Therapie multipler Infektionen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein für den klinischen Einsatz geeignetes, GMP-konformes und zeitsparendes Protokoll zur simultanen Isolierung und anschließenden Charakterisierung Antigen-spezifischer polyklonaler CD4+ und CD8+ T-Zellen gegen die nach allogener HSZT häufig auftretenden Viren Adenovirus (AdV), Epstein-Barr-Virus (EBV) und Cytomegalievirus (CMV) evaluiert. Als Isolationsmethode wurde der Cytokine Sekretion Assay (CSA) in Kombination mit magnetischer Anreicherung nach Antigenstimulation gewählt. Dabei war es möglich, selbst aus sehr geringen Ausgangsfrequenzen und unterschiedlicher Dominanz einzelner Spezifitäten eine simultane Isolation von Antigen-spezifischen T-Zellen gegen AdV, EBV und CMV durchzuführen. Mit der Entwicklung eines geeigneten Expansionsprotokolls wurden die angereicherten T-Zellen nach einer 14-tägigen Expansion hinsichtlich ihrer Virus-Spezifität, Polyfunktionalität und Epitopspezifität untersucht. Von sieben nach GMP-Richtlinien durchgeführten Isolationen Virus-spezifischer T-Zellen war die Anreicherung aller im Screening gefundener Spezifitäten in sechs Fällen (86%) erfolgreich. Je nach Antigen waren 3-33% der CD4+ und 7-35% der CD8+ T-Zellen polyfunktional im Sinne einer simultanen Sekretion von IFNg, TNFα und IL-2. Ebenso war es möglich, unter den isolierten Virus-spezifischen T-Zellen für alle untersuchten Spender epitopspezifische T-Zellen gegen HLA-gematchte Peptide nachzuweisen. In der Praxis hat sich die gewählte Screening-Methode – ein direkt ex vivo durchgeführtes intrazelluläres FACS auf IFNg-Produktion – leider als nicht ausreichend prädikativ erwiesen, da die geringen Frequenzen Virus-spezifischer T-Zellen zu nahe an der Nachweisgrenze liegen. Eine Isolation Virus-spezifischer T-Zellen gegen die im Screening als positiv eingestuften Spezifitäten war unter den CD4+ T-Zellen nur zu 91% (20/22) und unter den CD8+ T-Zellen nur zu 85% (22/26) möglich. Hier könnte für die Zukunft über eine dem Screening vorangehende Antigen-spezifische Expansion nachgedacht werden. In einigen Fällen war es bereits möglich, die klinische Wirksamkeit der so isolierten „Multivirus-spezifischen“ T-Zellen im Rahmen von sogenannten „individuellen Heilversuchen“ nachzuweisen. Das hier entwickelte GMP-konforme Protokoll zur simultanen Isolierung Antigen-spezifischer T-Zellen gegen AdV, EBV und CMV bietet somit eine attraktive Behandlungsoption bei viralen Infektionen nach allogener HSZT. Für einen Wirksamkeitsnachweis sollten jedoch GCP-konforme, kontrollierte klinische Studien durchgeführt werden.