Investigations on immune sensing of Staphylococcus aureus in allergic and inflammatory bowel diseases

Abstract

Die Erkennung von Bakterien, wie z.B. von Staphylococcus aureus (S. aureus), durch unser Immunsystem wird durch spezielle keimbahn-codierte „pattern recognition receptors“ (PRRs) des angeborenen Immunsystems vermittelt. Diese sogenannten Toll-like-Rezeptoren (TLRs) und NOD-Rezeptoren („Nucleotide-binding oligomerization domaincontaining proteins“) werden fast ubiquitär auf und innerhalb vieler Zelltypen exprimiert, wie z.B. Epithel- und Immunzellen. Diese Rezeptoren sind in der Lage unterschiedliche und hoch konservierte bakterielle Moleküle zu erkennen, wie z.B. das Lipopolysaccharid (LPS über TLR4), Lipoproteine (LPPs über TLR 2/1 und 2/6 TLR) und, basierend auf der Literatur, auch das Peptidoglycan (PGN über TLR2, PGN-Fragmente über NOD2), welches den Hauptbestandteil der bakteriellen Zellwand darstellt. Das Ziel dieser Arbeit war es die Rolle des PGNs in der Aktivierung des Immunsystems und einen möglichen Einfluss auf Krankheiten, wie atopischer Dermatitis, Morbus Crohn, ulcerativer Colitis und Nahrungsmittelallergien zu eruieren. Dazu wurde ein neuartiges Verfahren zur Isolierung von hochreinem PGN in ausreichenden Mengen entwickelt und das isolierte PGN und dessen Fragmente, sowie synthetische Lipopeptide, in in-vitro-Zellassays getestet. Wir konnten zeigen, dass beispielsweise reines, polymeres PGN (> 5mer, PGNpol), isoliert aus einer LPP-defizienten S. aureus SA113-Mutante (SA113Δlgt), keine Immunantwort und Reifung von dendritischen Zellen (DCs) induzierte. Eine Kostimulation von polymerem PGN mit einem TLR2-Liganden, bei dem es sich um LPP-Rückstände innerhalb des PGNs aus einem Wildtyp S. aureus (SA113) handelte, führte dahingegen zu einem signifikanten Anstieg der IL-6-, als auch der IL-12p40-Sekretion und der jeweiligen DC-Reifungsmarker (MHC-II, CD40). Eine ähnliche Reaktion konnte auch bei der Stimulation einer Monozyten-Zelllinie (Mono-Mac-6-Zellen) und einer Makrophagen-Zelllinie (J774-Zellen) beobachtet werden. Nur eine Kostimulation führte zu einer signifikanten IL-8 bzw. TNF-α-Induktion. Ferner führte die kutane in-vivo-Applikation von lebenden S. aureus-Zellen bei Mäusen zur Inhibierung einer adaptiven Immunantwort durch die Expression von IL-6 und der damit verbundenen Rekrutierung Gr1+CD11b+ myeloider Suppressorzellen (MDSCs) an die Infektionsstelle. Bedeutender war jedoch, dass die Applikation eines TLR2/6-Liganden (Pam2Cys oder diacylierte LPPs), und nicht die Applikation eines TLR2/1-Liganden (Pam3Cys oder triacylierte LPPs), zur Migration von MDSCs an den Ort der Infektion führte. Diese MDSC-Rekrutierung reduzierte zudem den Grad der mit der Infektion einhergehenden Schwellung der Ohren der infizierten Mäuse. Diese Ergebnisse liefern eine Erklärung, wie Bakterien in der Lage sein können unsere Haut zu kolonisieren, ohne dabei eine Immunantwort zu induzieren. Darüber hinaus wurden Ovalbumin-exprimierende Staphylokokken-Stämme (intrazelluläre vs. extrazelluläre Expression) kloniert. Dazu wurde ein xylose-induzierbares Expressionssystem (basierend auf pTX-Vektoren) genutzt und die resultierenden Expressionsvektoren in mehrere Staphylokokken-Stämme transformiert (SA113Δspa, SA113Δlgt, SA113ΔoatA, SA113ΔtagO, S. carnosus TM300), welche u.a. in der Veränderungen in der Zellwand aufweisen. Die resultierenden Stämme wurden sequenziert und die Ovalbumin-Expression durch Western Blot-Analysen unter Verwendung eines monoklonalen Anti-Ovalbumin-Antikörpers und eines T-Zell-Proliferations-Assays verifiziert.

Sensing bacteria, such as Staphylococcus aureus (S. aureus), is based on the ability to recognize them via special germline encoded pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system, so called Toll-like receptors (TLRs) and Nucleotide-binding oligomerization domain-containing proteins (NODs). These receptors are expressed almost ubiquitously on and inside of several cells types, e.g. epithelial and immune cells. They are able to recognize distinct and highly conserved bacterial molecules, such as lipopolysaccharides (LPS via TLR4), lipoproteins (LPPs via TLR 2/1 and TLR 2/6) and, according to previous literature, peptidoglycan (PGN via TLR2, PGN fragments via NOD2), which is the main constituent of the bacterial cell wall. The aim of this work was to elucidate the role of PGN in activating the immune system and to investigate its putative role in diseases, such as atopic dermatitis, Morbus Crohn, ulcerative colitis and food allergies. Therefore, we developed a new method for isolating highly pure PGN in sufficient amounts and tested this molecule and its fragments, along with synthetic lipopeptides, in several invitro cell assays. For instance, we could show that pure polymeric PGN (>5mer, PGNpol), isolated from a LPP-deficient S. aureus SA113 mutant strain (SA113Δlgt), did not induce an immune response or maturation of murine dendritic cells (DCs). In contrast, co-stimulation of polymeric PGN with a TLR2 ligand, namely LPPs residing within the PGN meshwork of isolated PGN from a wildtype S. aureus strain (SA113), led to a significant increase in IL-6, as well as IL-12p40 and the respective maturation markers (MHC-II, CD40). A similar response was observed for stimulation of a monocytic cell line (Mono-Mac-6 cells) and a macrophage cell line (J774 cells), where application of PGNpol alone did not induce the expression and secretion of IL-8 and TNF-α, respectively. Furthermore, the cutaneous application of S. aureus in-vivo suppressed an adaptive immune response by expressing IL-6, which in turn induced and recruited Gr1+CD11b+ myeloid derived suppressor cells (MDSCs) to the site of infection. More importantly, application of a TLR2/6 ligand (Pam2Cys or diacylated LPPs) elicited the same response in vivo, but a TLR2/1 ligand (Pam3Cys or triacylated LPPs) could not achieve the same effect. MDSC recruitment also reduced the degree of ear swelling. These findings provide an explanation for why and how certain bacteria are able to colonize on our skin without inducing an immune response. In addition, to clarify a putative role of PGN in inducing allergies, ovalbumin-expressing staphylococcal strains (intracellular vs. extracellular expression) have been cloned, using a xylose-inducible expression system (staphylococcal pTX vectors). These constructs were transformed into several staphylococcal strains (SA113Δspa, SA113Δlgt, SA113ΔoatA, SA113ΔtagO, S. carnosus TM300), which differ in their cell wall composition. The resulting strains were sequenced and the ovalbumin-expression was verified by westernblot analysis using a monoclonal anti-ovalbumin antibody and in T cell proliferation assays. With these strains, we will be able to elucidate a putative role of PGN recognition in inducing or inhibiting allergic responses in-vitro and in-vivo.