Einfluss der Isolierung und Lagerung der neutrophilen Granulozyten auf ihre Funktion

Abstract

Die hier vorliegende medizinische Doktorarbeit über neutrophile Granulozyten ist in zwei Teile gegliedert. Im ersten Teil wird eine eingehende Charakterisierung der neutrophilen Granulozyten vorgenommen. Dabei wird – neben der Beschreibung der klassischen Funktionen der Granulozyten (Mechanismen der Chemotaxis, der Phagozytose und der Abtötungsmechanismen von Mikroorganismen) – auf verschiedene neue Aspekte eingegangen, die in den letzten Jahren das Bild dieser Zellen der unspezifischen Immunabwehr entscheidend erweitert haben (alternative Interpretationen der Rolle von ROS bei der Abtötung der Mikroorganismen; extrazelluläres killing durch NETs; Präsens von T-Zell-Rezeptoren bei einer Subpopulation der Neutrophilen; Rolle der Neutrophilen als Supressorzellen). Im zweiten, dem experimentellen Teil der Arbeit, wird insbesondere der Frage nachgegangen, welchen Einfluss die Isolierung und anschließende kurzzeitige Lagerung der Granulozyten auf ihre Eigenschaften und Funktionen aufweist. In Gegensatz zu anderen Blutzellen sind neutrophile Granulozyten recht labile, kurzlebige Zellen, eine Tatsache, die bei experimentellen Arbeiten, aber auch hinsichtlich der klinischen Anwendungen (Granulozyten-Transfusionen) zu berücksichtigen ist. Untersuchungen am Blutbildanalysator ADVIA120, der die Leukozyten u.a. über die lysosomale Myeloperoxidase (MPO) der neutrophilen Granulozyten charakterisiert, haben gezeigt, dass es bereits während ihrer Isolierung aus dem Vollblut zu einer massiven Degranulation kommt. Da Neutrophile ihren Energiestoffwechsel (ATP-Produktion aus Glukose) praktisch ausschließlich über die anaerobe Glykolyse durchführen, wurden der Glykogenstatus, der Glukoseumsatz, die Laktatproduktion sowie der ATP-Satus nach bis zu 24-stündiger Lagerung untersucht: Während innerhalb der ersten Stunden kaum Abweichungen im Vergleich zur direkten Bestimmung nach der Isolierung zu verzeichnen waren, sind nach 24 Stunden gravierende Abnahmen zu verzeichnen. Ähnlich stellt sich die Situation bei Funktionsprozessen (Messung des „oxidativen bursts“ nach Aktivierung mit opsonisiertem Zymosan) dar. Die Lagerung in Gegenwart von G-CSF bzw. GM-CSF führte nur zu einer geringfügigen Stabilisierung der meisten untersuchten Parameter über die Lagerungsdauer. Insgesamt kann aus diesen Untersuchungen abgeleitet werden, dass a) die Entfernung der Granulozyten aus dem Vollblut trotz der relativ schonenden Isolierung (Histopaque®-Gradientenzentrifugation) bereits zu einer Beeinträchtigung der Stabilität (Degranulation) führt, und b) die isolierten Granulozyten in den ersten Stunden danach relativ stabil bleiben und erst bei längerer Inkubationszeit (> 4 - 24 Stunden) massive Funktionsverluste zeigen. Untersuchungen mit Granulozyten sollten somit so schnell wie möglich nach ihrer Isolierung durchgeführt werden. In einem weiteren Versuchsblock wurde abschließend der Frage nachgegangen, ob und wie die nach obigen Schema gewonnenen Granulozyten in der Lage sind, in der ADCC-Reaktion (engl.: „antibody dependent cellular cytotoxity“) Neuroblastomzellen abzutöten. Aus Voruntersuchungen war bekannt, dass der bereits klinisch angewandte Antikörper „CHIMERIC Antibody CH 14.18” (= AK+), der gegen das Gangliosid GD2 gerichtet ist, in Gegenwart von G-CSF bzw. GM- CSF Neuroblastomzellen im Rahmen der Granulozyten-ADCC abtöten kann, wobei dieser Prozess ohne die Bildung reaktiver Sauerstoffverbindungen abläuft. Versuche mit diesem gegen das Gangliosid GD2 gerichteten AK mit Komplementbindungsstelle (AK+) haben jedoch gezeigt, dass dazu allerdings recht hohe E:T-Verhältnisse und ebenso eine Voraktivierung der Granulozyten mit G- CSF bzw. GM-CSF erforderlich sind (Bruchelt et al, 1989). Im klinischen Alltag führte der Einsatz von AK+ zu massiven Nebenwirkungen (u.a. Schmerzen; Yu et al, 1998) bei den Patienten. Deshalb wurde ein Antikörper hergestellt, der diese Komplementbindungsstelle nicht besitzt (MoAb Hu 14.18, = AK-). In den durchgeführten Untersuchungen wurde mit Hilfe des Europium-Assays untersucht, ob nun auch AK- diese ADCC-Reaktionen auslösen kann, und welchen Einfluss eine Voraktivierung mit Biobran® auf diese Reaktion hat. Ferner wurde untersucht, ob AK- seine Wirkung ohne die Bildung von ROS ausübt, wie das für AK+ bereits bekannt ist. Hierbei zeigte sich, dass sowohl das Ausmaß der ADCC als auch der Wirkungsmechanismus (keine Bildung reaktiver Sauerstoffverbindungen) ähnlich wie bei Einsatz des Antikörpers AK+ waren.