Evolutionary Conservation in the Biogenesis of β-Barrel Proteins

Abstract

The vast majority of outer membrane proteins (OMPs) in Gram-negative bacteria belong to the class of membrane-embedded β-barrel proteins. Besides Gram-negative bacteria, the presence of these proteins is restricted to the outer membranes (OM) of the eukaryotic organelles mitochondria and chloroplasts. This can be seen as evidence for the endosymbiotic theory, according to which these organelles derived from the engulfment of prokaryotic ancestors into a progenitor of the eukaryotic cell. The process of organellogenesis led to a major DNA transfer of genes encoding mitochondrial proteins to the host genome. As a consequence, more than 99% of the proteins in present-day mitochondria are encoded in the nucleus and thus have to contain all the information required for specific sorting to their target compartment within mitochondria. Although progress has been made in understanding the targeting signals in numerous mitochondrial proteins, the signal that ensures targeting of β-barrel proteins still remains elusive. It is remarkable that in all membranes harboring these proteins the assembly is facilitated by dedicated protein complexes that contain a highly conserved central β-barrel protein termed BamA/YaeT/Omp85 in Gram-negative bacteria and Tob55/Sam50 in mitochondria. In this context it is astonishing that in spite of a very long divergent evolution of pro- and eukaryotes, mitochondria retained the ability to recognize and assemble bacterial β-barrel proteins. Due to this evolutionary conservation, yeast mitochondria can provide us a useful model system to study the biogenesis of β-barrel proteins from different origin. Currently, little is known about the signal that ensures specific targeting of β-barrel proteins to either mitochondria or chloroplasts. To shed light on this topic, I investigated the targeting of the chloroplast β-barrel proteins Oep24 and Oep37 upon their expression in yeast cells. We could demonstrate their exclusive localization to the mitochondrial outer membrane (MOM). Assembly of Oep37 partially complemented the growth phenotype of yeast cells lacking the general metabolite transporter Porin. Interestingly, both proteins followed in yeast cells a pathway similar to the one undertaken by bona fide mitochondrial β-barrel proteins. In another part of my studies I investigated targeting of the trimeric autotransporter protein Yersinia adhesin A (YadA). Specifically, I was interested in the mechanism by which precursors of such proteins cross the periplasm and assemble in the OM. To that goal, we took advantage of the evolutionary conservation in the biogenesis of β-barrel proteins between bacteria and mitochondria. Upon expression in yeast cells, both monomeric and trimeric forms of YadA were targeted to mitochondria, but solely the trimeric form was fully assembled into the MOM. Remarkably, the co-expression of YadA with a mitochondrially-targeted form of the bacterial periplasmic chaperone Skp, but not with SurA or SecB, resulted in elevated levels of YadA. Taken together, the results presented in this thesis demonstrate that in the course of evolution mitochondria retained the ability to assemble a wide range of β-barrel proteins. This ability allows insights into the nature of the β-barrel targeting signal.

Die überwiegende Mehrzahl der Aussenmembranproteine in Gram-negativen Bakterien gehört zur Klasse der membranständigen β-barrel Proteine. Das Vorkommen dieser Proteine ist neben Gram-negativen Bakterien auf die Aussenmembranen der eukaryotischen Organellen Mitochondrien und Chloroplasten beschränkt. Dies kann als Beleg für die Endosymbiontentheorie betrachtet werden, gemäß welcher diese Organellen von der Aufnahme prokaryotischer Vorfahren in einen Vorläufer der eukaryotischen Zelle abstammen. Der Verlauf der Organellenevolution führte zu einem bedeutenden DNA-Transfer von Genen, die für mitochondriale Proteine kodieren, in das Wirtsgenom. Als Folge dessen sind in heutigen Mitochondrien mehr als 99% der Proteine im Kern kodiert und müssen alle Informationen enthalten, die für einen spezifischen Transport zum mitochondrialen Zielkompartiment benötigt werden. Obwohl Fortschritte im Verständnis der Transportsignale zahlreicher mitochondrialer Proteine gemacht werden konnten, ist das Signal, das den Transport und die Erkennung von β-barrel Proteinen sicherstellt noch immer unbekannt. Es ist bemerkenswert, dass die Assemblierung dieser Proteine in allen Membranen von speziell dafür vorgesehenen Proteinkomplexen ermöglicht wird. Diese Komplexe enthalten ein zentrales, hochkonserviertes β-barrel Protein, das in Gram-negativen Bakterien als BamA/YaeT/Omp85 und in Mitochondrien als Tob55/Sam50 bezeichnet wird. In diesem Zusammenhang ist es erstaunlich, dass Mitochondrien trotz der sehr langen divergenten Evolution von Pro- und Eukaryoten, die Fähigkeit bewahrt haben, bakterielle β-barrel Proteine zu Erkennen und zu Assemblieren. Aufgrund dieser evolutionären Konservierung, liefern uns Mitochondrien ein nützliches Modellsystem zur Untersuchung der Biogenese von β-barrel Proteinen unterschiedlichen Ursprungs. Bislang ist wenig über das Erkennungssignal bekannt, das den Transport von β-barrel Proteinen zu Mitochondrien oder Chloroplasten sicherstellt. Um Erkenntnisse über dieses zu gewinnen, habe ich den Transport und die Erkennung der plastidären β-barrel Proteine Oep24 und Oep37 in Hefezellen untersucht. Wir konnten zeigen, dass diese ausschließlich in die mitochondriale Aussenmembran eingebaut wurden. Die Insertion von Oep37 konnte den Wachstumsphänotyp von Hefezellen, denen der Metabolittransporter Porin fehlt, teilweise komplementieren. Interessanterweise folgten beide Proteine in Hefezellen einem Biogeneseweg, der dem endogener mitochondrialer β-barrel Proteine ähnlich war. In einem anderen Teil meiner Arbeit untersuchte ich die Erkennung und den Transport des trimeren Autotransporterproteins Yersinia adhesin A (YadA). Dabei interessierte ich mich im Speziellen für den Mechanismus durch den Vorläufer dieser Proteine das Periplasma durchqueren und sich in die Aussenmembran assemblieren. Zu diesem Zweck haben wir uns die evolutionäre Konservierung in der Biogenese von β-barrel Proteinen zwischen Bakterien und Mitochondrien zu Nutze gemacht. Nach der Expression in Hefezellen wurden sowohl monomeres als auch trimeres YadA in Mitochondrien detektiert, wobei nur die trimere Form komplett in die mitochondriale Aussenmembrane eingebaut wurde. Bemerkenswerterweise führte die gemeinsame Expression von YadA und einer im Intermembranraum lokalisierten Version des baktierellen periplasmatischen Chaperones Skp zu erhöhten Mengen beider Formen von YadA. Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse dieser Dissertation, dass Mitochondrien im Laufe der Evolution die Fähigkeit erhalten haben, eine Vielzahl von β-barrel Proteinen zu assemblieren. Diese Fähigkeit erlaubt Einblicke in die Beschaffenheit des Erkennungssignals in β-barrel Proteinen.