Analyse zur globalen Genexpression in Geweben des frühen Arabidopsis thaliana Embryos

Abstract

Die Entstehung vielzelliger Eukaryonten bestehend aus unterschiedlichsten Zell- sowie Gewebetypen beruht auf zellulären Differenzierungsprozessen von pluripotenten und nicht endgültig differenzierten Zellen. Damit diese Stammzellen in Zellen mit spezifischen Aufgaben differenziert werden können, ist eine Veränderung der zellulären Genexpression grundlegend. Daher ist das Wissen über unterschiedliche Genexpressionsmuster sowie deren Zustandekommen unerlässlich für ein tieferes Verständnis von entwicklungsbiologischen Aspekten. Bei den Bedecktsamern (Angiospermen) wie der Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) wird der Grundbauplan während der frühen Embryogenese ausgebildet. Dabei sind bereits im sogenannten embryonalen Herzstadium alle drei Achsen (apikal-basale, radiale, bilaterale), das Spross- sowie das Wurzelmeristems, die beiden Keimblätter (Kotyledonen) und das Hypokotyl festgelegt. Zu Beginn der Embryogenese markiert in Arabidopsis bereits die erste Zellteilung der Zygote die apikal-basale Symmetrieebene, wobei die beiden daraus resultierenden Tochterzellen in der Folge grundlegend verschiedene Entwicklungsrichtungen einschlagen. Während die Nachkommen der apikale Zelle durch Teilungen in verschiedenen Ebenen einen sphärischen Zellverband, den sogenannten Proembryo ausbilden, teilen sich die Nachkommen der basalen Zelle ausschliesslich horizontal und es entsteht dadurch eine einzige Zellreihe, der sogenannte Suspensor. Aufgrund seiner geringen Größe und der Tatsache, dass der Embryo bei Blütenpflanzen meist sehr tief im maternalen Gewebe eingebettet ist, waren Untersuchungen auf Transkriptomebene in der Vergangenheit kaum möglich. In dieser Arbeit wurde exemplarisch am frühen Arabidopsis Embryo eine Methode entwickelt, mit deren Hilfe Genexpressionsprofile von Zellkernen des Proembryos und des Suspensors sowie auch des gesamten Embryos erstellt wurden. Dafür wurden gewebespezifische Markerlinien in Pflanzen etabliert, deren extrahierte Kerne mittels fluoreszenzbasierter Durchflusszytometrie, sogenanntem fluorescence-activated nuclear sorting (FANS) aufgereinigt wurden. Schliesslich wurde die Boten-RNA (mRNA) der Zellkerne über DNA-Microarrays analysiert. Durch Vergleich mit dem Genexpressionsprofil aus Zellen ganzer, intakter Embryonen vergleichbaren, embryonalen Stadiums konnte die Ähnlichkeit von Kernen und Zellen auf der Ebene der Genexpression gezeigt werden. Die statistisch signifikanten Unterschiede im Genexpressionsmuster zwischen apikalem und basalem Embryonalgewebe wurden in vivo mittels Promoter-Reporter Fusionskonstrukten sowie RNA in situ Hybridisierung verifiziert. Überdies konnte gezeigt werden, dass die hier vorgestellte Methode Vorteile gegenüber der vormals angewendeten Laser-Mikrodissektion bietet. Mit dieser Methode sollte es möglich sein, aus schwerzugänglichen Geweben mit geringer Zellzahl auch in anderen Organismen verlässliche Genexpressionsprofile herzustellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern ausserdem eine nützliche Datenbank auf transkriptioneller Ebene für zukünftige Studien in der frühen Embryogenese von Arabidopsis thaliana.