Development and Application of Quantitative Proteomic Strategies to Study the Cell Cycle in Fission Yeast

Abstract

With the increasing amount of genomic data available, it became obvious that complete genome sequences are not sufficient to elucidate a clear biological function. Proteomics focuses on the gene products (proteins) and their posttranslational modifications (PTMs) in an unbiased and global fashion. Proteomics has become an indispensable tool in the study of molecular and cellular biology, and is becoming increasingly important for systems biology approaches. It highly profits from the development and improvements in technology, especially in mass spectrometry and liquid chromatography. Modern mass spectrometry-based approaches are capable of routinely identifying and quantifying thousands of proteins and post-translational modifications in a single biological experiment.

The aim of this thesis was to develop and optimize quantitative mass spectrometry-based approaches to study protein phosphorylation dynamics, and apply them to study the cell cycle of fission yeast. To this end, I improved a (phospho)proteomic workflow based on in-solution proteome digestion, phosphopeptide enrichment and the use of strong cation exchange and TiO2 chromatographies. I replaced the commonly used additive 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) with high concentration of trifluoroacetic acid (TFA), thereby increasing the specificity of the phosphopeptide enrichment while reducing contamination of the mass spectrometer. With this approach it became possible to identify thousands of phosphorylation events with relatively low starting material (1 - 2 mg).

Proteomics can be applied to study complex biological processes such as the cell cycle. The cell cycle involves a complex series of highly regulated and evolutionary conserved events. Aberrations in the cell cycle have severe implications and can cause cancerous growth; therefore, a detailed understanding of the cell cycle and its regulation may identify additional targets for cancer therapy. In this work, I used the model organism Schizosaccharomyces pombe, also known as fission yeast, to characterize proteome and phosphoproteome dynamics in the main phases of the cell cycle. S. pombe is an extensively exploited model organism used to study cell cycle control, heterochromatin and differentiation. Here I used shot-gun proteomics in combination with a stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) method, termed super-SILAC, and intensity-based absolute quantification (iBAQ). Combining these methods I was able to measure relative and absolute dynamics of the proteome and phosphoproteome during the four main phases of the cell cycle of fission yeast (G1, S, G2 and M). Using highly synchronized cells provided by Silke Hauf´s laboratory, I estimated copy numbers for 3,178 S. pombe proteins and 3,682 phosphorylation events and relatively quantified 65 % of the data across all phases. This data was combined with calculated phosphorylation site stoichiometry to estimate the total amount of protein-bound phosphate and its dynamics across the cell cycle. Quantitative changes during the cell cycle were infrequent and weak at the proteome level, but prominent at the phosphoproteome level. Protein phosphorylation peaked in mitosis, where the median phosphorylation site occupancy was 44%, about two-fold higher than in other phases. Using the iBAQ approach, I measured copy numbers of 3,178 proteins and combined this information with phosphorylation site stoichiometry to estimate the absolute amount of protein-bound phosphate, as well as its change across the cell cycle. The results indicated that 23% of the average intracellular ATP is utilized by protein kinases to phosphorylate their substrates in order to drive regulatory processes during cell division. Accordingly, I observed that phosphate transporters and phosphate-metabolizing enzymes are phosphorylated and therefore likely to be regulated in mitosis. This is one of the first studies to describe global phosphorylation site stoichiometry and the first study to combine this information with absolute protein copy number to calculate ATP dynamics during the cell cycle. This will be a valuable resource for systems biologists and we hope it will encourage researchers to expand this approach to other modifications to help better understand PTM dynamics.

Finally, in collaboration with Ian Hagan´s lab we observed that labeling fission yeast with a frequently used version of arginine (13C615N4-arginine) lead to severe mislabeling of multiple amino acids and severely compromises the identification of heavy-labeled peptides and therefore of proteins. This inability to use 13C615N4-arginine in triple-SILAC experiments limits the exploitation of SILAC technology in fission yeast. Through experiments using different combinations of SILAC labels we reasoned that the guanidinium group of 13C615N4-arginine is catabolized to 15N1-ammonia that is used as a precursor for general amino acid biosynthesis. As a consequence, 15N is randomly incorporated in newly synthetized amino acids and at a later point in newly synthetized proteins. In order to prevent this arginine conversion, we optimized the fission yeast strain previously used for SILAC experiments and growth conditions. We show that disruption of Ni2+-dependent urease activity, through deletion of the sole Ni2+ transporter Nic1 in combination with ammonium-supplemented medium, blocks this re-cycling to enable 13C615N4-arginine labeling for SILAC strategies in S. pombe. The ability to routinely perform triple-SILAC experiments with doubly- labelled samples (i.e. Arg and Lys) will increase proteome coverage and increase experimental options to understand core principles of molecular cell biology. Finally, our study will point the way towards solving of arginine-related labeling problems in SILAC experiments in other species.

Mit der zunehmenden Verfügbarkeit von Genomdaten wurde deutlich, dass die vollständigen Genomsequenzen nicht ausreichend sind, um eine eindeutige biologische Funktion aufzuklären. Proteomik ist eine unvoreingenommene und umfassende Methode, die sich mit Genprodukten (Proteine) und deren posttranslationalen Modifikationen (PTM) beschäftigt. Sie hat sich als ein unverzichtbares Werkzeug in molekularen und zellbiologischen Studien etabliert und wird immer wichtiger für die Systembiologie. Proteomik profitiert stark vom technologischen Fortschritt, vor allem in der Massenspektrometrie und der Flüssigkeitschromatographie. Mit Hilfe moderner, auf der Massenspektrometrie basierender Versuche, ist man in der Lage, routinemäßig tausende von Proteinen und posttranslationale Modifikationen in einem biologischen Experiment zu identifizieren und zu quantifizieren.

Ziel dieser Doktorarbeit war die Entwicklung und Optimierung quantitativer Massenspektrometrie-basierter Ansätze zur Untersuchung der Phosphorylierungsdynamik von Proteinen und diese anschließend zur Analyse des Zellzyklus der Spalthefe anzuwenden. Zu diesem Zweck verbesserte ich einen Phosphoproteom-Workflow, basierend auf einem Proteinverdau in Lösung, Phosphopeptidanreicherung und der Verwendung von Ionenaustausch- und TiO2-Chromatographien. Ich ersetzte die üblicherweise verwendete 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) gegen eine hohe Konzentration an Trifluoressigsäure (TFA), wodurch die Spezifität der Phosphopeptidanreicherung erhöht und gleichzeitig die Kontamination des Massenspektrometers reduziert wurde. Mit diesem Ansatz ist es möglich, tausende von Phosphorylierungsstellen von Proteinen mit relativ niedrigem Ausgangsmaterial zu identifizieren (1 - 2 mg).

Proteomik kann angewendet werden, um komplexe biologische Prozesse wie den Zellzyklus zu untersuchen. Der Zellzyklus umfasst eine komplexe Reihe von hochregulierten und evolutionär konservierten Vorgängen. Aberrationen im Zellzyklus haben schwere Auswirkungen und können Krebswachstum verursachen. Daher kann ein genaues Verständnis des Zellzyklus und seiner Regulation zur Identifizierung weiterer Targets in der Krebstherapie führen. In dieser Arbeit habe ich den Modellorganismus Schizosaccharomyces pombe benutzt, der auch als Spalthefe bekannt ist, um die Dynamik des Proteoms und des Phosphoproteoms in den wichtigsten Phasen des Zellzyklus zu charakterisieren. S. pombe ist ein etablierter Modellorganismus, der verwendet wird, um unter anderem Zellzykluskontrolle, Heterochromatin und Differenzierung zu studieren. Hier habe ich Massenspektrometrie-basierte Proteomikmethoden in Kombination mit stabiler Isotopenmarkierung von Aminosäuren in Zellkultur (SILAC), genannt Super-SILAC, und intensitätsbasierter absoluter Quantifizierung (iBAQ) verwendet. Durch Kombination dieser Methoden konnte ich die relative und absolute Dynamik des Proteoms und Phosphoproteoms während der vier Hauptphasen des Zellzyklus der Spalthefe (G1, S, G2 und M) charakterisieren. An den von Silke Hauf´s Labor zur Verfügung gestellten hoch synchronisierten Zellen berechnete ich die Kopiezahlen für 3.178 S. pombe Proteine und 3.682 Phosphorylierungsereignisse und 65% der Daten konnten über alle Phasen relativ quantifiziert werden. Diese Daten wurden mit der Stöchiometrieberechnung von Phosphorylierungsstellen kombiniert, um die Gesamtmenge an proteingebundenem Phosphat und seine Dynamik über den Zellzyklus zu bestimmen. Quantitative Veränderungen während des Zellzyklus waren auf Proteomebene selten und schwach, aber deutlich auf Phosphoproteomebene. Der Level an Proteinphosphorylierung erreichte in der Mitose seinen Höhepunkt, wo der Median der besetzten Phosphorylierungsstellen bei 44% lag, etwa zweifach höher als in anderen Phasen. Mit dem iBAQ Ansatz maß ich Kopiezahlen von 3.178 Proteinen und kombinierte diese Informationen mit jenen aus der Stöchiometrieberechnung der Phosphorylierungsstellen, um die absolute Menge an proteingebundenem Phosphat, sowie dessen Veränderung über den Zellzyklus bestimmen zu können. Die Ergebnisse zeigten, dass 23% des durchschnittlichen intrazellulären ATPs durch Proteinkinasen genutzt wird, um ihre Substrate für regulatorische Prozesse während der Zellteilung zu phosphorylieren. In Übereinstimmung habe ich festgestellt, dass Phosphat-Transporter und phosphatmetabolisierende Enzyme phosphoryliert und daher wahrscheinlich in der Mitose reguliert werden. Dies ist eine der ersten Studien über die globale Stöchiometrie von Phosphorylierungsstellen und die erste Studie, die diese Informationen mit der absoluten Kopiezahl von Proteinen kombiniert, um die ATP-Dynamik während des Zellzyklus zu berechnen. Sie wird eine wertvolle Quelle für Systembiologen sein, und wir hoffen, dass sie Forscher dazu ermutigt, diesen Ansatz auf andere Modifikationen zu erweitern, um die PTM Dynamik besser zu verstehen.

Abschließend wurde in Zusammenarbeit mit Iain Hagan´s Labor beobachtet, dass es bei der Markierung der Spalthefe mit der häufig verwendeten Version von „schwerem“ Arginin (13C615N4-Arginin) zur schwerwiegenden Falschmarkierung zahlreicher Aminosäuren kommt, was die Identifizierung von markierten Peptiden und zugehörigen Proteinen erheblich beeinträchtigt. Die Tatsache, dass 13C615N4-Arginin nicht in Triple-SILAC Experimenten benutzt werden kann, stellt eine erhebliche Einschränkung der SILAC-Technologie in Experimenten in der Spalthefe dar. Durch Versuche mit verschiedenen SILAC-Aminosäuren fanden wir heraus, dass die Guanidinium-Gruppe von 13C615N4-Arginin in 15N1-Ammoniak katabolisiert wird, welches weiter als Vorläufer für die allgemeine Aminosäure-Biosynthese dient. Als Folge wird 15N zufällig in neu synthetisierte Aminosäuren und zu einem späteren Zeitpunkt in neu synthetisierte Proteine eingebaut. Um diese Arginin-Umwandlung zu verhindern, optimierten wir den zuvor für SILAC Experimente benutzten Stamm der Spalthefe. Ich konnte zeigen, dass die Unterbrechung der Ni2+-abhängigen Urease-Aktivität durch den Knockout des einzigen Ni2+-Transporters Nic1 in Verbindung mit einem durch Ammonium ergänzten Medium, die Katabolisierung verhindert und somit eine 13C615N4-Arginin-Markierung für SILAC Experimente in S. pombe ermöglicht. Die Fähigkeit, Triple-SILAC Experimente routinemäßig mit zweifach-markierten Proben (d.h. Arg und Lys) einzusetzen, wird die Tiefe der Proteom Abdeckung erhöhen und erweitert somit die experimentellen Möglichkeiten, grundlegende Prinzipien der molekularen Zellbiologie besser zu verstehen. Die Ergebnisse dieser Studie können auf andere Spezies übertragen werden, um Arginin-bezogene Markierungsprobleme in SILAC Experimenten zu beseitigen.