Einfluss VP2-kodierender Sequenzen und verschiedener Translationsinitiationsfaktoren auf die Translationsreinitiation des kleinen Kapsidproteins beim Felinen Calicivirus

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URI: http://hdl.handle.net/10900/57373
http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-dspace-573737
Dokumentart: Dissertation
Date: 2014
Language: German
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Biochemie
Advisor: Meyers, Gregor (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2014-09-19
DDC Classifikation: 000 - Computer science, information and general works
500 - Natural sciences and mathematics
570 - Life sciences; biology
Keywords: Translation <Genetik>
Other Keywords: Calicivirus
Felines Calicivirus
Translation
Translationsinitiation
Reinitiation
Translationsinitiationsfaktor
translation initiation factor
translation initiation
Feline calicivirus
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Inhaltszusammenfassung:

Die Familie der Caliciviridae umfasst human- und tierpathogene, nicht umhüllte Viren mit einem einzelsträngigen RNA Genom positiver Polarität. Die caliciviralen Strukturproteine werden ausgehend von einer subgenomischen RNA translatiert, die zwei überlappende Leserahmen enthält. Das erste Leseraster kodiert für das Hauptkapsidprotein VP1 und das zweite für das minore Kapsidprotein VP2. Die Translation der VP2 Proteine des Felinen Calicivirus (FCV) und des Rabbit Haemorrhagic Disease Virus (RHDV) wird durch Reinitiation initiiert. Die Termination Upstream Ribosomal Binding Site (TURBS) am 3‘-Ende der VP1 kodierenden Sequenz ist essentiell für die Reinitiation zur VP2 Synthese. In dieser Arbeit wurden weiterführende Untersuchungen zum Terminations/Reinitiations-Mechanismus vorgenommen. Um Anhaltspunkten nachzugehen, die nahelegten, dass 5‘-terminale Sequenzen der VP2 kodierenden Region des FCV für die Reinitiation von Bedeutung sind, wurden im ersten Teil dieser Arbeit Sequenzen stromab der Start/Stoppregion in transienten Expressionsstudien analysiert. Dadurch konnte gezeigt werden, dass Mutationen innerhalb der Start/Stoppstelle zu sehr unterschiedlichen VP2 Expressionsleveln führten. Des Weiteren wurden neben dem „Wildtyp“ Stoppkodon #1 die drei anderen Stoppkodone stromab der Start/Stoppstelle untersucht. Es wurde nachgewiesen, dass das „Wildtyp“ Stoppkodon #1 nicht überlesen wird und das Stoppkodon #4 keine Funktion besitzt. Die Rolle von Stoppkodon #2 und #3 bleibt aber weiterhin unklar, da manche Veränderungen der Stoppkodone #2 und #3 die VP2 Expression erniedrigten, andere aber die Reinitiationsrate erhöhten. Nachdem die unterschiedlichen Expressionslevel nicht durch die Primärsequenz erklärt werden konnten, wurde die potentielle Sekundärstruktur analysiert. Hierbei wurde kein definiertes Motiv gefunden, das über längere Sequenzabschnitte der FCV RNA hinweg mit der Start/Stoppregion interagiert. Auffällig bei in silico Sequenzanalysen war jedoch eine Haarnadelformation am 5‘-Ende der VP2 kodierenden Sequenz des FCV. Bei gleichartigen in silico Analysen für RHDV wurde eine ähnliche Haarnadelschleife mit noch größerer Stabilität gefunden. Eine eindeutige Verbindung zwischen Lage und Stabilität dieser Sekundärstruktur und der VP2 Expression war indes nicht erkennbar. Denkbar wäre, dass diese Struktur nicht notwendig ist, aber die Abbremsung des translatierenden Ribosoms kurz vor Erreichen der Start/Stoppstelle und den Prozess der Reinitiation fördert und dadurch die Reinitiationsrate steigern kann. Eine deutlich erhöhte Stabilität der Haarnadelschleife schien dagegen das Ribosom zu behindern und damit die Reinitiation zu reduzieren. Letztlich bleibt festzuhalten, dass die VP2 kodierende Sequenz signifikant die Reinitiationsrate beim FCV beeinflusste. Ein klares Modell zum molekularen Mechanismus, der diesem Effekt zu Grunde liegt, ließ sich jedoch weder bezüglich der primären Sequenz noch der ermittelten Sekundärstruktur ableiten. Obwohl alternative Mechanismen der Translationsinitiation oft nur einen Teil der üblichen Translationsinitiationsfaktoren erfordern, bedarf die Reinitiation vermutlich einer ganzen Reihe zellulärer Faktoren. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden daher mit Hilfe der RNA-Interferenz (RNAi) gezielt einzelne Translationsinitiationsfaktoren in vivo ausgeschaltet, um damit ihren Einfluss auf die Reinitiation bei der Synthese des VP2 des FCV zu untersuchen. Bei diesen Analysen wurde eIF4E als Kontrolle genutzt, da eine starke Reduzierung des Faktors mittels RNAi bereits publiziert war. Zusammen mit den Translationsinitiationsfaktoren eIF5B, eIF5 und eIF5A wurde eIF4E mittels shRNA herunterreguliert und anschließend beobachtet, inwieweit die VP2 Expression beeinflusst wurde. Es konnte gezeigt werden, dass das Level der für die fraglichen Translationsinitiationsfaktoren kodierenden mRNA nach Transfektion des jeweiligen shRNA Plasmid Mixes deutlich sank. Die zelluläre Proteinsynthese wurde durch diese Behandlung aber nur mäßig reduziert. Trotz der nur kleinen Effekte auf die Gesamtproteinsynthese wurden die Auswirkungen der herabgesetzten Verfügbarkeit der Translationsinitiationsfaktoren auf die VP2 Expression untersucht. Jedoch reduzierte der Mangel an Translationsinitiationsfaktoren die Cap-abhängige VP1 Translation so stark, dass die VP2 Synthese auf ein nicht mehr eindeutig zu quantifizierendes Maß sank. Das hier benutze in vivo System zur Identifizierung der zellulären Faktoren, die für den Terminations/Reinitiations-Mechanismus erforderlich sind, hat sich als äußerst komplex herausgestellt und erlaubte nur bedingt Schlussfolgerungen. Es konnte keine eindeutige Aussage über den Einfluss der Translationsinitiationsfaktoren eIF4E, eIF5A, eIF5 und eIF5B auf die Reinitiation getroffen werden. In der Endphase dieser Arbeit wurden daher erste in vitro Versuchsansätze unternommen. Die in dieser Doktorarbeit vorgestellten Daten zeigen, dass neben der TURBS vermutlich noch eine Reihe weiterer Faktoren wie die Sequenzen in der Nachbarschaft der Start/Stoppstelle und Sekundärstrukturelemente den Terminations/Reinitiations-Mechanismus beeinflussen. Die Arbeiten ergaben zudem Hinweise auf eine Rolle einzelner Translationsinitiationsfaktoren bei diesem Prozess, die aber aufbauend auf den zuletzt getesteten Methoden weiter untersucht werden muss.

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