Proteomic Analysis Suggests a Role for HtrA Serine Peptidase 1 in Immune Regulation and Thereby in Age-Related Macular Degeneration

Abstract

Purpose. Single-Nucleotide Polymorphisms on chromosome 10 at the region 10q26 that harbors the three genes, PLEKHA1, ARMS2 and HtrA1, show strong association with the pathogenesis of age-related macular degeneration (AMD). In the last decade, evidence was mounted that mutations in the HtrA1 gene are a major causative factor of this disorder in Caucasian populations. The current study was undertaken in order to enhance the understanding the role of this HtrA1 in the pathogenesis of AMD.

Methods. A HtrA1 gene trap mouse model was employed to compare the differences in protein expression between the gene trap mouse and a wild type mouse. ARPE19 and HeLa cells were transfected with a plasmid coding for triple-tagged, proteolytically inactive HtrA1. Next, a Co-IP assay was used to isolate HtrA1 interacting proteins. Selected candidates were validated with Western blot. Potential substrates of HtrA1 were tested by an in vitro digestion assay.

Results. Our study indicated that HtrA1 as a secreted protein binds to various complement components, e.g. CFP, CFD, CFI, C1r, C1s, C2, C3 and C5 in the classical pathway, as well as to components of the lectin-mediated pathway and, in particular, to components of the alternative pathway. Several of these components have been implicated in the pathological process of age-related macular degeneration. Notably, a regulatory component of the innate immune activity, Ubiquitin-like protein ISG15 directly interacts with HtrA1 in our Co-IP. Furthermore, our in vitro digestion assay showed that Ubiquitin-like protein ISG15 is a substrate of HtrA1 protease.

Conclusion. The aberrant activation of the complement system by HtrA1 found in our assays underlies the importance of the immune system in the pathogenesis of AMD. Our results suggest that HtrA1 may exert its biological function through the regulation of the immune system.

ZIEL: Einzelnukleotid-Polymorphismen (englisch: Single-Nucleotide Polymorphisms, SNP) in dem chromosomalen Bereich 10q26, der die drei Gene PLEKHA1, ARMS2 und HtrA1 enthält, zeigen eine starke Assoziation mit der Pathogenese der Altersbedingten Makuladegeneration (AMD). In den letzten zehn Jahren haben sich zahlreiche Anzeichen dafür gehäuft, dass eine Hauptursache der Erkrankung in einer Mutation des HtrA1 Gens liegen könnte. Mit dieser Studie sollte daher die pathologische Rolle des Gens bzw. Proteins weiter aufgeklärt werden.

METHODEN: Ein HtrA1 "gene trap" Mausmodell wurde verwendet, um die Proteinexpression zwischen der gene trap Maus und der Wildtyp Maus zu vergleichen. Des Weiteren wurden ARPE19 Zellen und HeLa Zellen mit einem HtrA1-Plasmid transfiziert, das einen dreifach Tag trägt und für proteolytisch inaktives HtrA1 kodiert. Mittels Co-Immunopräzipitation wurden dann die Proteine präzipitiert, die mit HtrA1 interagieren. Interessante Kandidaten wurden mit Western Blot überprüft. Potentielle HtrA1 Substrats, wurden mittels in vitro Verdau getestet.

ERGEBNISSE: Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass HtrA1 als ein sekretiertes Protein an verschiedene Komponenten des Komplementsystems binden kann, und zwar an die Komponenten CFP, CFD, CFI, C1r, C1s, C2, C3 und C5 aus dem klassischen Weg, sowie an Komponenten des Lektin-Weges und besonders an Komponenten des alternativen Weges. Einige dieser Proteine stehen im Zusammenhang mit der Pathogenese der Altersbedingten Makuladegeneration. Insbesondere konnten wir zeigen, dass das Ubiquitin-like protein ISG15 bei Co-Immunopräzipitation direkt mit HtrA1 interagiert. Bei einem in vitro Verdau war Ubiquitin-like protein ISG15 auch ein Substrat für HtrA1.

AUSWERUNG: Die Aktivierung des Komplementsystems durch HtrA1, die wir unseren Assays gefunden haben, unterstützt die Vermutung, dass das Immunsystem eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese von AMD spielt. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen vermuten, dass HtrA1 die Aktivität des Immunsystems reguliert.