On the Origin and Differentiation of Melanophores in Zebrafish, Danio rerio

Abstract

The neural crest is a vertebrate specific, developmentally transient population of pluripotent stem cells capable of crossing germ layer boundaries and differentiating into a multitude of different tissues. In Zebrafish, one of these cell types, the pigment cells of the body, first appear and differentiate in early embryos contributing to a stereotypical larval pigmentation pattern composed of melanophores, xanthophores and iridophores. At juvenile stages the larval pigmentation pattern undergoes a rapid transformation with the appearance of large numbers of newly arriving pigment cells that develop into the adult striped pattern of zebrafish skin. These melanophores arise from an undifferentiated cell population. Although ontogenetically derived from the neural crest, their exact source in juvenile and adult fish has remained unclear. Here I present the source of the late appearing melanophores of the adult pattern to be derived from a stem cell population, set aside early in development at the future site of the dorsal root ganglia as part of the peripheral nervous system. The melanophore progenitors use the spinal nerves as migratory routes leading to the hypodermis at the periphery. Using mutants, morpholino and small molecule inhibition, I dissect the specific roles of ErbB and Kit signaling in the establishment of the melanophore stem cells and the role of dorsal root ganglia as their niche. By combining blastula transplantation and live imaging techniques I have identified melanophore progenitor cells during regeneration becoming active at the site of the dorsal root ganglia. I have followed their lineage until melanization, thereby confirming their specific fate. Furthermore, I show the requirement of these melanophore stem cells for the adult pigment cell population. Continuing along with melanophore maturation and differentiation, I have positionally cloned the zebrafish albino mutant and present mutations in slc45a2 encoding a solute carrier protein as causing the phenotype. In humans, mutations in SLC45A2 lead to oculocutaneous albinism type IV and single nucleotide polymorphisms (SNPs) at this locus are associated with skin color variation, but little is known about the function of SLC45A2 in melanization. I present evidence for a role of Slc45a2 in pH and ionic homeostasis inside melanosomes and show how variation of these conditions affects the key melanin producing enzyme, tyrosinase. I also show that mutations in sandy/tyrosinase lead to a destruction of melanosomes with toxic effects to neighboring tissues. Taken together these results provide insight into the large amount of variation in SLC45A2 across many animals as opposed to the relative low variation associated with TYROSINASE in humans.

Die Neuralleiste besteht aus einer Population von pluripotenten Stammzellen, die als embryonale Anlage bei der Entwicklung von Wirbeltieren entstehen. Zellen der Neuralleiste sind in der Lage, sich zu einer Vielzahl von Zelltypen zu differenzieren, wie unter anderem zu Pigmentzellen. In Zebrafischen erscheinen Pigmentzellen zuerst während der Embryonalentwicklung, und bilden ein typisches larvales Farbmuster aus. Später, während des jugendlichen Stadiums, entstehen eine Anzahl von neuen Pigmentzellen, die das Farbmusters des adulten Fisches bilden. Die Melanophoren dieses Musters entstammen einer undifferenzierten Zellpopulation, die von der Neuralleiste abgeleitet ist. Jedoch war ihr genauer Ursprung im jugendlichen und adulten Fisch bisher unbekannt. Ich beschreibe hier, dass die Vorläuferzellen der adulten Melanophoren einer Stammzellpopulation entstammen, die bereits früh während der Entwicklung segmental neben den Ganglien (Dorsal Root Ganglion, DRG) des peripheren Nervensystems angelegt wird. Nach ihrer Aktivierung wandern die Melanophorenstammzellen dann entlang der Spinalnerven in die Haut des Fisches hinein. Durch Analyse verschiedener Zebrafischmutanten, Injektionen von Morpholinos oder Nutzung von Hemmstoffen konnte ich die spezifischen Rollen der ErbB-und Kit-Signalwege bei der Anlage dieser Stammzellen am DRG und die Rolle des DRGs als Stammzellnische aufgliedern. Durch Transplantationsexperimente von Blastulazellen kombiniert mit Zeitrafferfilmen konnte ich die Aktivierung der Melanophorenstammzellen am DRG beobachten, ihre Entwicklung bis zum Zeitpunkt der Melanisierung verfolgen und somit ihre spezifische Herkunft nachweisen. Desweiteren zeige ich, dass diese Melanophorenstammzellen die adulten Melanophoren hervorbringen. Im Zusammenhang mit meiner Analyse der Differenzierung von Melanophoren habe ich die albino Zebrafischmutation positional kloniert und zeige, dass Mutationen im Gen slc45a2, welches ein Transmembran-Transportprotein kodiert, den albino Phänotyp verursachen. Im Menschen führen Mutationen in SLC45A2 zu okulokutanem Albinismus Typ IV. Polymorphismen an diesem Genlocus sind mit unterschiedlichen Hautfarben assoziiert, jedoch ist sehr wenig über die genaue Funktion von SLC45A2 im Melanisierungsprozess bekannt. Ich zeige, dass Slc45a2 möglicherweise eine Rolle bei der Kontrolle der pH- und ionischen Homöostase innerhalb der Melanosomen spielt, und demonstriere, wie eine Veränderung der Bedingungen ein Schlüsselenzym des Melaninstoffwechsels, Tyrosinase, beeinflussen. Weiterhin zeige ich, dass Mutationen in sandy/tyrosinase zur Zerstörung von Melanosomen und damit einhergehenden toxischen Effekten auf das umliegende Gewebe führen. Diese Ergebnisse erklären das Auftreten der vielfältigen bekannten Variationen in SLC45A2 in vielen Tierarten, im Gegensatz zu der relativ seltenen Variation im TYROSINASE Gen.