Salt Effects in Protein Solutions

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URI: http://hdl.handle.net/10900/53863
http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-dspace-538638
Dokumentart: Dissertation
Date: 2014
Language: English
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Physik
Advisor: Schreiber, Frank (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2013-12-19
DDC Classifikation: 530 - Physics
Keywords: Physik , Proteine , Weiche Materie , Kristallisation , Keimbildung , Kondensation
Other Keywords: Salzeffekte
Proteinloesungen
Phasenverhalten
phase behavior
protein solutions
salt effects
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Inhaltszusammenfassung:

Das Phasenverhalten von Proteinlösungen sowie die Wechselwirkungen zwischen Proteinen werden durch die Hinzugabe von Salzen beeinflusst. Der Mechanismus der salzinduzierten Effekte ist dabei wichtiger Bestandteil des theoretischen Verstöndnisses sowie Grundlage für biotechnologische Anwendungen in Proteinlösungen. Das grundlegende Bild für Salze ohne spezifische Wechselwirkung mit den Proteinen beinhaltet die DLVO-Theorie und die verbundene elektrochemische Doppelschicht. Im Allgemeinen kann die Wechselwirkung zwischen Proteinoberfläche und Ionen sehr spezifisch sein, wie z.B. bei Bindestellen für Ionen. Als einen ersten vorbereitenden Schritt werden Proteinlösungen mit Salzen entlang der Hofmeister-Reihe untersucht. Die Protein-Interaktionen werden mit Kleinwinkelstreuung charakterisiert und lassen sich mit einem Modell von effektiven Kugeln beschreiben, wenn Hydratisationseffekte und die nicht-sphärische Form der Proteine adäquat berücksichtigt werden. Das Resultat, dass eine kolloidartige Modellierung für Proteine möglich ist, wird durch die Invarianz der Konformation der untersuchten Proteine unter verschiedenen Salzbedingungen unterstützt. Der Hauptteil der Arbeit untersucht Phänomene in Proteinlösungen, die von mehrwertigen Kationen induziert werden. Als allen anderen Phänomenen zugrundeliegend wurde schon in vorherigen Studien eine Umkehr der Proteinladung beobachtet, sowie eine damit verbundene „Reentrant Condensation“, also eine klare und stabilisierte Lösung bei kleinen und groß en Salzkonzentrationen, während die Proteinlösung bei mittleren Salzkonzentrationen ausfällt oder phasensepariert. In dieser Arbeit wurde der Einfluss verschiedener Kationen und zusätzlichen einwertigen Salzes auf die „Reentrant Condensation“ untersucht. Während Metallsalze mit starken pH-Effekten aus der Salzhydrolyse das Kondensationsregime deutlich verkleinern, verschiebt zusätzliches einwertiges Salz das Kondensationsregime zu höheren Salzkonzentrationen. Die Ladungsinversion wird erfolgreich mit einem Modell beschrieben, das das Wechselspiel von Ionenbindung, Ladungsregulation und pH-Effekten berücksichtigt. Das Phasenverhalten kann dem Zusammenwirken von einer ioneninduzierten Anziehung und einer Ladungsstabilisation, die durch die Ladungsumkehr in ihrer Stärke variiert, zugeschrieben werden. Interessanterweise wird in einem Bereich der Kondensation eine Flüssig-Flüssig-Phasenkoexistenz beobachtet. Die Proteininteraktionen werden mit Kleinwinkelstreuung vermessen und stimmen mit Erwartungen der Kolloidtheorie überein. Nahe der niedrig konzentrierten Phasengrenze wird Kristallisation beobachtet, während die hoch konzentrierte Proteinphase amorphe Aggregate ausbildet. Proteinkristallisation in der dünneren Phase wird detaillierter diskutiert und führt zu der Vermutung, dass eine zweistufige Nukleation über einen Oligomer-Zwischenschritt auftritt. Hinweise auf diesen Prozess werden aus Echtzeit-Kleinwinkelstreuung gewonnen. Abschließ end wird das vielfältige Phasenverhalten der Proteinlösungen mit einem Modell von Kugeln mit ionenaktivierten attraktiven Oberflächenregionen beschrieben. Diese Regionen entsprechen dabei Bindestellen für Kationen und modellieren die attraktive Wechselwirkung zwischen Proteinen durch Ionenbrückenbildung, wenn genau ein Kation gebunden ist. Mit diesem Modell können sowohl die Flüssig-Flüssig-Phasenkoexistenz als auch die „Reentrant Condensation“ und Oligomerbildung beschrieben werden. Weiterhin lassen sich die beobachteten Kristallisationsprozesse verstehen, indem berücksichtigt wird, dass die hochkonzentrierte Proteinphase durch viele Ionenbrücken eventuell kinetisch daran gehindert wird, sich zu einem Kristall umzuordnen.

Abstract:

The addition of salts to protein solutions affects both the protein interaction and the related phase behavior, invoking the question how the protein--ion interaction can induce these effects. For salts without specific protein--ion interactions, the DLVO theory for solubility and the formation of the electrostatic double-layer represents the basic picture. The interaction of ions with the protein surface, however, can be affected by several effects such as specific binding sites or water-mediated features. In a first step, protein solutions with different salts along the Hofmeister series are investigated. Protein interactions are characterized by small-angle scattering and can be successfully described with a model of effective spheres if hydration and non-spherical shape are accounted for. Colloid-like modeling of proteins is employed in several studies throughout the thesis, and opportunities as well as limitations of the modeling approaches are discussed. In the main part of the thesis, phenomena in protein solutions induced by multivalent cations are studied. As the basic phenomenon, an inversion of the protein net charge and a related reentrant condensation---i.e.~stable solutions at low and high cation concentrations, condensation at intermediate cation concentrations---has been observed in earlier studies. In this thesis, the influence of different cations as well as the effect of additional monovalent salt on the reentrant condensation is investigated. Metal salts with strong pH effects due to hydrolysis narrow the condensed regime considerably. Additional monovalent salt increases both transition concentrations of the reentrant condensation. These effects are described successfully by a coarse-grained model accounting for the interplay of ion binding, charge regulation and pH effects due to hydrolysis. The reentrant phase behavior is attributed to the competition of an ion-induced attraction and the reentrant charge stabilization through the charge inversion. Exploring the reentrant phase diagram in greater detail, a liquid--liquid phase separation (LLPS) is observed in a closed area within the condensed regime. The phase boundaries as well as the protein interactions measured by small-angle scattering are interpreted consistently with a colloidal picture of a metastable LLPS with two control parameters. Close to the dilute phase boundary, crystal growth is found, whereas amorphous aggregates are formed in the dense coexisting phase. The protein crystallization from the dilute phase is studied in more detail, and a two-step nucleation pathway via cluster precursor is suggested and evidenced by real-time SAXS measurements. The rich phase diagram of protein solutions with multivalent cations is described by a model of particles with ion-activated attractive patches in a very natural and conceptually understandable way. The patches represent binding sites for the cations and, once a cation is bound, act as attractive patches caused by ion bridging. The LLPS, the reentrant condensation, and cluster formation are reproduced with excellent qualitative and reasonable quantitative agreement. Furthermore, the crystallization pathways are rationalized by the percolated and potentially arrested structures in the dense coexisting phase.

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