Functional Characterization of SERRATE Interacting Proteins

Abstract

Plant microRNAs (miRNAs) regulate many aspects of plant development including hormone responses, floral development and phyllotaxy. Mature miRNAs associate with ARGONAUTE (AGO) proteins to bind and regulate target mRNAs. Mature miRNAs are released from longer primary miRNAs (pri-miRNA) by the RNaseIII-like enzyme DICER-LIKE 1 (DCL1). Additional RNA binding proteins including SERRATE (SE), HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1), TOUGH (TGH) and the CAP BINDING COMPLEX (CBC) facilitate efficient and precise processing of pri-miRNA transcripts. SE and the CBC are of particular interest, because they fulfill an additional function in pre messanger RNA (pre-mRNA) splicing. This leads to the hypothesis that SE and CBC build a platform, which recruits different RNA processing factors to Polymerase II derived transcripts. I could show by using physical and genetic interaction studies as well as molecular analyses that SE and the CBC form a higher-order complex. Each component is equally required for accurate pri miRNA processing and splicing. In order to identify new components, which might be recruited by the SE/CBC complex, we conducted a yeast to hybrid screen using SE as bait. The eukaryotic WD40 repeat containing scaffold protein RECEPTOR FOR ACTIVATED C KINASE (RACK1) was discovered as a putative SE interacting protein and I analyzed the function of RACK1 in respect to RNA processing. The Arabidopsis genome encodes three RACK1 genes (A, B, C), which control plant development throughout the life cycle. Molecular, biochemical and phenotypic analyses of rack1 and known miRNA mutants lead me to the conclusion that RACK1 affects multiple steps of the miRNA pathway. In rack1 mutants, mature miRNAs accumulate only to low levels and several miRNAs were not accurately diced from their respective pri-miRNAs. In addition, some pri-miRNA transcripts are elevated in rack1 mutants implying that the RACK1/SERRATE interaction is important for early steps of the miRNA biogenesis. In line with the observation that RACK1 is a novel miRNA factor, I found that miRNA targeted mRNAs are misregulated in rack1 mutants and that rack1 mutants exhibit typical phenotypic alteration that are often associated with reduced miRNA levels (e.g ABA hypersensitivity or phyllotaxy defects). However, vegetative phase change, which is tightly controlled by an interwoven network with miR156 as a central player, is not accelerated as in other miRNA mutants, but delayed in rack1 mutants. Further analyses suggested that RACK1 influences the expression miR156 targeted SPL transcription factors independently of its function in miR156 maturation. Taken together, my results revealed that the SERRATE interacting scaffold protein RACK1 is a novel component of the plant miRNA pathway and that RACK1 affects plant development through miRNA dependent and independent mechanisms.

MicroRNAs (miRNA) spielen eine bedeutende Rolle in der pflanzlichen Entwicklung. Sie regulieren dabei wichtige Prozesse wie Hormonantworten, Blatt- und Blütenentwicklung sowie die Phyllotaxis. miRNAs sind negative Regulatoren der Genexpression und wirken auf post-transkriptioneller Ebene. Dabei binden ARGONAUTE Effektorproteine reife miRNAs, welche sequenzspezifisch Ziel-mRNAs erkennen und regulieren. Reife miRNAs werden aus längeren primary-miRNA-Transkripten (pri-miRNA) durch das RNaseIII ähnliche Enzym DICER-LIKE 1 (DCL1) generiert. Weitere Proteine unterstützen DCL1 bei der effizienten und genauen Prozessierung der pri-miRNAs, unter anderem die RNA-bindenden Proteine SERRATE (SE), HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1), TOUGH (TGH) und der CAP BINDING COMPLEX (CBC). SE und der CBC sind von besonderem Interesse, da sie eine zusätzlich Rolle beim Spleißen von pre-messenger RNAs (pre-mRNAs) spielen. Dies führte zur Annahme, dass SE und der CBC ein Gerüst bilden, das unterschiedliche RNA Prozessierungsfaktoren zu verschiedenen RNA Spezies rekrutiert. Mit Hilfe genetischer und physischer Interaktionsstudien sowie molekularer Analysen konnte ich zeigen, dass SE in der Tat mit dem CBC interagiert. Eine Hefe-Zweihybrid Sichtung, in der SE als Köder eingesetzt wurde, führte zur Identifikation neuer putativer Interaktionspartner. Darunter befand sich das eukaryotische Gerüstprotein RECEPTOR FOR ACTIVATED C KINASE (RACK1), welches näher auf seine Funktion in der RNA Prozessierung hin untersucht wurde. Das Genom von Arabidopsis kodiert für drei RACK1 Gene (A, B, C), welche essentiell für die pflanzliche Entwicklung sind. Durch molekulare, biochemische und phänotypische Analysen von rack1-Mutanten konnte ich zeigen, dass RACK1 mehrere Schritte der miRNA Biogenese beeinflusst. rack1-Mutanten akkumulieren geringere Mengen reifer miRNAs, was charakteristisch für bekannte miRNA-Biogenesemutanten wie se oder hyl1 ist. Einige pri miRNA-Transkripte werden zudem schlechter in rack1-Mutanten prozessiert, was darauf hindeutet, dass die SE/RACK1-Interaktion eine wichtige Funktion in der frühen miRNA Biogenese spielt. Eine fehlerhafte miRNA Biogenese beeinflusst die durch miRNA regulierten Ziel-mRNAs. Verschiedene dieser miRNA-Zielgene sind in rack1-Mutanten misreguliert und die damit einhergehenden phänotypischen Veränderungen wie z. B. ABA-Hypersensitivität und phyllotaktische Defekte, konnten in rack1-Mutanten beobachtet werden. Interessanterweise zeigen rack1 Mutanten nicht alle durch miRNAs ausgelöste Defekte, wie zum Beispiel die Regulation des Wechsels von der juvenilen zur adulten Phase. Meine Ergebnisse deuten darauf hin, dass RACK1 Entwicklungsprozesse durch miRNA-abhängige und miRNA unabhängige Wirkmechanismen beeinflusst. Zusammenfassend konnte ich in meiner Doktorarbeit zeigen, dass SE mit einem neuen miRNA Faktor, RACK1, interagiert, der verschiedene Funktionen bei der Reifung von miRNAs ausübt und so einige miRNA-gesteuerte pflanzliche Entwicklungsprozesse beeinflusst.