Durchflusszytometrische Untersuchungen von Oberflächenepitopen von mesenchymalen Stammzellen unter kardiomyogener Differenzierung

Abstract

Bislang muss sich die Therapie des Akuten Koronarsyndroms, insbesondere im Falle eines Myokardinfarktes, auf die Reperfusion des ischämischen Myokardareals beschränken. Eine Restitutio ad integrum ist nicht möglich. Eine vorstellbare therapeutische Alternative könnte die Behandlung mit Kardiomyozyten bzw. mesenchymalen Stammzellen (MSC) darstellen. Dazu ist es Voraussetzung, die Kardiomyozyten bzw. MSCs therapeutisch sicher einsetzen zu können. Hier könnten MSCs aus Knochenmark eine interessante Methode darstellen, da sie einfach zu gewinnen sind und aufgrund ihrer Multipotenz die Fähigkeit zur kardiomyogenen Differenzierung haben. Ziel dieser Arbeit war es, die zahlreichen vorbeschriebenen kardiomygogenen Differenzierungsmedien mittels durchflusszytometrischer Analyse miteinander zu vergleichen. Des Weiteren sollte mit dieser Arbeit untersucht werden, inwiefern sich das Expressionsprofil der Oberflächenepitope im zeitlichen Verlauf und unter zunehmender kardiomyogener Differenzierung veränderte. Mittels Durchflusszytometrie wurden die Oberflächenepitope CD10, CD31, CD45, CD71, CD73, CD90, CD105, CD106, CD117, CD243, CD309 und GD2 untersucht. Die Kriterien der International Society of Cellular Therapy (ISCT) fanden hierbei Anwendung, womit eine Vergleichbarkeit der gewonnenen Ergebnisse gewährleistet ist. Die Expression der von uns untersuchten Oberflächenepitope veränderte sich im zeitlichen Verlauf, spezifische Veränderungen, die kausal mit einer bestimmten Substanz der verwendeten Differenzierungsmedien in Zusammenhang stehen, konnten jedoch nicht beobachtet werden. So ließ sich die Herauf- bzw. Herunterregulierung der Oberflächenepitope an Zellen unter Einfluss von Differenzierungsmedium, wie auch an den unbehandelten MSC, in ähnlicher Ausprägung nachweisen. Bezüglich des Oberflächenepitops CD105 ließ sich unter Anwendung des Mediums Insulin-Transferrin-Ascorbat-Dexamethason (ITAD) ein Abfall der Expression in Passage 2 beobachten. In Passage 3 und 4 stiegen die Werte deutlich über die der anderen untersuchten Zellen. Da sich dies nur bei einer der drei von uns untersuchten Populationen zeigte, ist auch denkbar, dass es sich hierbei um eine Subpopulation gehandelt haben könnte, die sich spontan differenzierte und verstärkt vermehren konnte. Wir sahen, dass die von uns verwendeten Oberflächenmerkmale zur durchflusszytometrischen Suche von Zellen, die sich in kardiomyogener Differenzierung befinden, nicht geeignet sind. So korrelierten die Ergebnisse der RT-PCR, die in einer separaten Arbeit zu finden sind, nicht mit den Messungen mittels Durchflusszytometrie. Das heißt, eine Induktion von kardialen Markergenen und eine damit zusammenhängende kardiale Differenzierung konnte mittels der von uns untersuchten Oberflächenmarker nicht nachvollzogen werden. Es kann jedoch gesagt werden, dass die ursprünglich zur Bestätigung der MSC geforderte Markerkonstellation gemäß ISCT auch während der Kultur mit kardiomyogenen Differenzierungsmedien erhalten blieb. Die Durchflusszytometrie könnte zur weiteren Untersuchung von Subpopulationen eine geeignete Methode sein, da hierdurch Zellen mit besonderer Wachstumskinetik oder Differenzierungspotenz isoliert werden könnten. Diese Subpopulationen weitergehend zu untersuchen, muss Auftrag künftiger Forschung sein, um die Regulation der Differenzierung von MSC besser verstehen zu können.

Until today the therapy of the acute coronary syndrome, especially of the myocardial infarction, is based on the reperfusion of the ischaemic heart muscle but restitutio ad integrum is not possible. A thinkable alternative treatment could be based on the injection of cardiomyocytes or mesenchymal stem cells (msc) into ischaemic areas of the heart. A safe use of this method is therefore a prerequisite since a spontaneous differentiation into another tissue could have desastrous effects. MSC derived from human bone marrow are very interesting as they are multipotent cells that also have the possibility to differentiate into cadiomyogenic cells. In this paper we compared different cardiomyogenic differentiation protocols by cytometric analysis. Further the change of surface epitopes of cells under cardiomyogenic differentiation in long term in vitro culture was to be assessed. Therefore following epitopes were examined by using flow cytometry: CD10, CD31, CD45, CD 71, CD73, CD90, CD105, CD106, CD117, CD243, CD309 and GD2. The cell populations were selected according to the definition criteria released by the International Society of Cellular Therapy (ISCT). With ongoing in vitro culture the expression of the cells' surface epitopes changed, but specific changes that could be related to a certain substance or differentiation protocol, could not be observed. The up or down regulation of examined surface epitopes were similar in msc treated with a cardiomyogenic differentiation protocol and msc treated with standard medium. When regarding CD105 we observed a down regulation in passage 2 by using the protocol ITAD (insuline-transferrin-ascorbat-dexamethasone). In passage 3 and 4 the up regulation of CD105 exceeded the levels of all other cells. Since only one out of three examined populations showed this behaviour it is possible that we discovered a subpopulation which differentiated spontaneously and was able to grow faster than other cells. The above surface epitopes examined by using flow cytometry in order to find cells in cardiomyogenic differentiation were not qualified. The results by using PCR (polymerase chain reaction) did not match the results by using flow cytometry. That means that cells expressing myocardial genes underwent an myocardial differentiation. However this could not be observed by an simultaneously up or down regulation of above surface epitopes. The necessary criteria of the ISCT for msc was met throughout the passages. Flow cytometry could be the right method for searching, examining and isolating subpopulations with special growth rates and differentiation potential. Examining these subpopulations any further has to be done by future research in order to understand the regulation and differentiation potential of msc.