Inhaltszusammenfassung:
Die Resorption von NaCl im Darm erfolgt elektroneutral durch die die beiden Antiporter NHE3 (Na+/H+) und DRA (Cl-/HCO3-). Eine Mutation von DRA führt zur autosomal-rezessiv vererbten kongenitalen Chloriddiarrhoe. DRA wird nicht nur im Darm, sondern auch in zahlreichen weiteren Organen exprimiert. Teilweise fungiert es hier als Partner von CFTR. Bislang ist neben der indirekten Regulation von DRA durch Regulation seiner Partnertransporter ausschließlich die Calciumvermittelte Regulation als direkter Regulationsmechanismus von DRA bekannt. Ziel dieser Arbeit war es diesen Regulationsmechanismus näher zu charakterisieren und die Rolle des hierbei beteiligten PDZ-Adapterproteins PDZK1 zu klären.
In bereits vorhandenen, stabil transfizierten HEK und Caco-2 Zelllinien wurde fluoreszenzsspektroskopisch die intrazelluläre Calciumkonzentration und der pH Wert gemessen. Die HEK Zellen, welche keine endogene Expression der beteiligten Proteine besitzen waren mit EGFP-DRA/DsRedmono-PDZK1 transfiziert. Die Caco- 2 Zellen, welche bereits eine endogene Expression besitzen waren entweder nur mit EGFP-DRA oder mit EGFP-DRA/DsRedmono-PDZK1 transfiziert. Letztere besaßen somit eine Überexpression von PDZK1. Fura-2/AM und BECF/AM wurden als Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt. Zur Steuerung des Messgerätes wurde hierzu eine eigens programmierte Software verwendet. Die intrazelluläre Calciumkonzentration wurde mittels BAPTA/AM und 4-Bromo A23187 moduliert. Mittels Oberflächenbiotinylierung wurde die Oberflächenexpression von DRA bestimmt.
Es zeigte sich, dass die parallele Messung mit den oben genannten Farbstoffen einige Einschränkungen mit sich bringt. Die sichere Bestimmung der Calciumkonzentration aus den gewonnenen Fura-2 Ratios gelang nicht, weshalb, wie in der Literatur ebenfalls üblich, nur die Fura-2 Ratio angegeben wurde. Die Calciumabhängigkeit der DRA-Aktivität konnte in allen Zelllinien nachgewiesen werden. In den Caco-2 Zellen konnte gezeigt werden, dass die Hemmung von DRA durch Calcium dynamisch ist. PDZK1 könnte hierbei als Sensitizer wirken. Klonale Einflüsse sind jedoch nicht sicher auszuschließen. Eine anhaltende Erhöhung der Calciumkonzentration bewirkt in den Caco-2 Zellen mit endogener PDZK1 Expression eine verminderte Oberflächenexpression. Dies spricht für einen Zweischritt-Mechanismus mit zunächst lokaler Hemmung und später Verminderung der Oberflächenexpression. Bei Überexpression von PDZK1 verbleibt die Oberflächenkonzentration von DRA konstant. PDZK1 könnte somit DRA in der Membran halten. Die Verminderung der Oberflächenexpression von DRA bei endogener PDZK1-Expression würde folglich durch vermehrten Ausbau aus der Plasmamembran erfolgen.
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