Untersuchung der Regulation der Aktivität des Aminosäuretransportes über SN1 durch die GSK3ß sowie die Regulation der Aktivität des Na+-gekoppelten Glukosetransportes über SGLT1 und der Aktivität der Na+/K+-ATPase durch ß-Catenin

Abstract

Das Protein ß-Catenin ist an der Bildung von Zell-Zell-Kontakten, den sogenannten Adherens-Junctions, beteiligt und fungiert als wichtiges Schlüsselprotein im Wnt-Signalweg. Durch den Wnt-Signalweg werden viele grundlegende zelluläre Prozesse, wie z.B. die Balance zwischen Proliferation und Differenzierung oder Überleben versus Apoptose, gesteuert. In der Pathogenese der polyzystischen Nierenerkrankung spielt ein Defekt im Wnt-Signalweg mit einer exzessiven Anreicherung von ß-Catenin eine Rolle. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von ß-Catenin auf den transmembranösen Transport durch die Na+/K+-ATPase und den Na+-gekoppelten Glukosetransporter SGLT1 untersucht. Es wurde hierfür das bereits seit langem etablierte Expressionssystem der Xenopus laevis-Oozyten in Kombination mit der TEVC-Methode und der Chemilumineszenz-basierten Bestimmung der Membranexpression angewendet. Zur Messung des transmembranösen Stromes über die Na+/K+-ATPase wurde die endogene Na+/K+-ATPase der Xenopus laevis-Oozyten verwendet. Hierbei wurden die K+-induzierten Ströme gemessen. Zu diesem Zweck wurden die Xenopus laevis-Oozyten 4 Stunden lang in K+-freier Lösung (ND96 – K+) präinkubiert und der induzierte K+-Strom nach K+-Zugabe zum Oozytenbad gemessen. Endogene Kaliumkanäle wurden zuvor mit dem K+-Kanalblocker BaCl2 (5 mM) inhibiert. Als Ergebnis dieser Arbeit zeigte sich, dass nach Injektion von cRNA von ß-Catenin in die Oozyten der K+-Pumpenstrom der endogenen Na+/K+-ATPase und der durch den Na+/K+-ATPase-Hemmer Ouabain-induzierte Strom signifikant höher waren als über die Zellmembran von Oozyten, welche anstelle cRNA von ß-Catenin DEPC-Wasser in gleicher Menge injiziert bekamen. Eine transkriptionelle Wirkung von ß-Catenin auf die Aktivität der Na+/K+-ATPase konnte durch weitere Versuche mit dem transkriptionshemmenden Peptidantibiotikums Actinomycin ausgeschlossen werden. Es kann somit die Aussage getroffen werden, dass der Effekt der Regulation der Aktivität der Na+/K+-ATPase durch ß-Catenin über posttranskriptionelle Mechanismen und nicht über transkriptionelle Hochregulation beispielsweise der SGK1 erfolgt. Auch in Oozyten, die mit cRNA des Na+-Glukose-Cotransporters SGLT1 injiziert wurden, zeigte die zusätzliche Injektion von cRNA des Proteins ß-Catenin einen stimulierenden Effekt. Weitere Untersuchungen ergaben, dass ß-Catenin die Membranexpression von SGLT1 verstärkt. Möglicherweise könnte ß-Catenin jedoch auch über eine Hochregulation bestimmter Kinasen wie der SGK1 oder über die Hochregulation der Na+/K+-ATPase Einfluss auf den Na+-gekoppelten Glukosetransport haben. Da ß-Catenin jedoch auch nach Inkubation der Oozyten mit dem Transkriptionshemmer Actinomycin eine Hochregulation der Aktivität der SGLT1 verursachte, kann auch hier festgestellt werden, dass posttranskriptionelle Vorgänge beteiligt sein müssen und nicht ausschließlich eine transkriptionelle Wirkung. Allerdings könnte die stimulierende Wirkung von ß-Catenin auf die SGLT1-Aktivität zumindest teilweise auf der Erhöhung der Triebkraft durch Aktivitätssteigerung der Na+/K+-ATPase beruhen. Die Ergebnisse vorliegender Arbeit zeigen nun eine komplett neue Funktion von ß-Catenin für die Regulation des transmembranösen Transports. Somit kann zusammengefasst werden, dass ß-Catenin die Na+/K+-ATPase und den elektrogenen Glukosetransport über den Na+-abhängigen Glukosetransporter SGLT1 stimuliert. Dieser Effekt entsteht vermutlich über eine direkte Interaktion mit den Zellmembranproteinen und ist unabhängig von der genomischen Hochregulation anderer Gene wie der SGK1. Für die Untersuchung der Regulation des Aminosäuretransportes über SN1 durch die GSK3ß konnte mit Hilfe der TEVC-Methode ermittelt werden, dass bei Koexpression von SN1 und der GSK3ß eine signifikante Erhöhung des transmembranösen, glutamininduzierten Stromes über die Oozytenmembran, im Vergleich zu Oozyten, welche nur SN1 exprimierten, besteht. Eine Expression der GSK3ß ohne SN1 zeigte keine Erhöhung des transmembranösen Stromes. Dadurch konnte bestätigt werden, dass die Erhöhung des transmembranösen Stromes über SN1 und nicht über andere Mechanismen erfolgt. Zudem wurden jejunale Gewebe von genveränderten GSK3KI-Mäusen, deren GSK3-Aktivität eine Resistenz gegenüber der PKB/SGK-vermittelten Hemmung aufwiesen, in Ussingkammerexperimenten mit jejunalem Gewebe von Wildtyp-Tieren verglichen. Dabei wurde ein gesteigerter intestinaler Aminosäure-transport in GSK3KI-Mäusen entdeckt. Die Ergebnisse vom Xenopus-Expressionssystem und die Resultate der Messungen mit der Ussingkammer legen nahe, dass die Glykogensynthasekinase 3 (GSK3) Einfluss auf den natriumabhängigen Aminosäuretransport nimmt. Der genaue Mechanismus muss in weiteren Untersuchungen ermittelt werden. Zusammengefasst wurden mit dieser Doktorarbeit neue Funktionen der Proteine ß-Catenin und GSK3 identifiziert. Beide Proteine regulieren den elektrogenen Membrantransport.