Are Epigenetic Mechanisms Involved in Axonal Regeneration?

Abstract

The purpose of this study was to elucidate the role of epigenetic mechanisms for the regulation of genes associated with axonal regeneration following peripheral sciatic nerve axotomy (SNA) as compared to central dorsal column axotomy (DCA). Axon regeneration is usually only successful in the peripheral system. According to the hypothesis, injury type dependent differential changes of the gene expression pattern were expected to be associated with corresponding changes of the epigenetic code. Specifically, gene promoter DNA hypermethylation would correlate with downregulation of regeneration-associated genes (RAGs) following injury, compared to sham. Inversely, promoter hypomethylation would correlate with an upregulation. Furthermore, specific histone modifications might be associated with injury-induced RAG expression.

Mouse dorsal root ganglia (DRG) were used as a suitable in vivo model for axon regeneration that allows the investigation of differential responses and effects to both types of nerve lesion within the same neurons. One, three, or seven days following either SNA or DCA, injury-induced changes of promoter-bound epigenetic marks were assayed and correlated to gene expression changes associated with axon regeneration. First, methylated DNA immunoprecipitation was combined with a special microarray for methylated DNA (MeDIP-chip) in the frame of a genome-wide promoter and CpG island (CGI) DNA methylation analysis. Altogether, 179 hyper- or hypomethylated genes were identified for both injury conditions. A subset of these genes was differentially methylated (DM) exhibiting injury-induced changes of methylation levels only upon SNA or DCA. Many of these genes were associated with functions in chromatin remodeling, transcription regulation, or neural development or differentiation. For a subset of the DM genes, the promoter methylation status correlated with gene expression changes upon injury according to the hypothesis. Gene expression of known major RAGs such as Gap43, Sprr1a, and Bdnf was verified to be upregulated solely upon SNA. However, most of these genes were not significantly methylated. Consequently, a promoter CGI analysis was performed for RAGs and DM genes to identify predictable correlations between promoter methylation status and CpG dinucleotide distribution. Almost all investigated genes, especially RAGs, have one or more CGIs within the proximal promoter region or close to the transcription start site (TSS), except Sprr1a. DM genes exhibited a higher normalized CpG density around the TSS than analyzed RAGs. Thereby, differentially hypermethylated genes had higher normalized CpG values than hypomethylated genes, and moderately induced RAGs had higher values compared to highly induced RAGs.

Second, increased expression of major RAGs was shown to be associated with increased promoter histone-3 lysine-9 acetylation (H3-K9ac), and decreased dimethylation (H3-K9me2) following peripheral injury. Overexpression of PCAF (KAT2B), a histone acetyltransferase for H3-K9, in dissociated mouse DRG neuron cultures, or in mouse cerebellar granule neurons enhanced neurite outgrowth, even on inhibitive CNS myelin. This was associated with the prevention of decreasing promoter H3-K9ac occupancy, and with increased RAG expression on myelin compared to a permissive substrate.

Altogether, promoter DNA methylation seems not to be majorly involved in regeneration-associated gene expression regulation although it seemed to be important for specific induced genes. However, H3-K9 acetylation specifically plays a role for RAG expression upon SNA and for promoting neurite outgrowth. Enhancing local promoter histone acetylation by overexpression of PCAF can even overpower the outgrowth inhibiting effects of CNS myelin in vitro inducing a certain degree of regeneration in cultured DRG neurons or CGN. This study succeeded to show that specific epigenetic mechanisms are involved in gene regulation in the frame of axonal regeneration, although the whole picture is still far from being complete. Further studies are mandatory and might help developing combinational clinical therapies for treatment of spinal cord injury.

Das Ziel dieser Studie war, die Rolle epigenetischer Mechanismen bei der Genregulation im Zusammenhang mit Axonregeneration aufzuklären. Insbesondere wurden hierzu zwei Typen von Nervenverletzung verglichen, die Axotomie des peripheren Ischiasnervs (SNA) und die Schädigung des dorsalen Rückenmarks (DCA). Eine spontane Regeneration von Axonen ist dabei nur im peripheren Nervensystem möglich. Der Hypothese entsprechend wurde erwartet, dass differenzielle Veränderungen des Genexpressions-Musters, abhängig vom Verletzungstyp, mit entsprechenden Änderungen im epigenetischen Code korrelieren. Insbesondere sollte eine verstärkte Genpromotor-DNA-Methylierung infolge der Axotomie, im Vergleich zur Scheinoperation als Kontrolle, mit einer Herunterregulierung von regenerations-assoziierten Genen (RAG) verbunden sein. Umgekehrt sollte eine verminderte Promoter-Methylierung mit einer Hoch¬regulierung korrelieren. Des Weiteren könnten auch spezifische Histon-Modifikationen die induzierte RAG-Expression kontrollieren.

Maus-Spinalganglien (dorsal root ganglia; DRG) wurden als geeignetes in vivo Modell für die Axonregeneration verwendet, welches erlaubt, differenzielle Effekte und Reaktionen auf beide Verletzungstypen im selben neuronalen System zu untersuchen. Ein, drei oder sieben Tage nach durchgeführter SNA beziehungsweise DCA wurden induzierte Veränderungen der promotorgebundenen epigenetischen Markierungen untersucht und in Bezug zu entsprechen-den Genexpressions-Veränderungen gesetzt. Zunächst wurde eine Immunpräzipitation von methylierter DNA mit einem speziellen Microarray-Typ kombiniert (MeDIP-chip), um genomweit das Methylierungsmuster von Genpromotoren und sogenannten CpG-Inseln (CGI) zu analysieren. Insgesamt wurden 179 hyper- oder hypomethylierte Gene für beide Arten von Nervenverletzungen identifiziert. Diese Gene waren zum Teil differenziell methyliert (DM), das heißt, sie wiesen verletzungsbedingte Veränderungen des Methylierungsmusters nur für einen Verletzungstyp auf. Viele von diesen Genen konnten mit Funktionen bei der Chromatin-Umgestaltung, der Transkriptions¬regulation oder in der (neuralen) Entwicklung beziehungsweise Zelldifferenzierung assoziiert werden. Jedoch nur für einen Teil der differenziell methylierten Gene konnten der Hypothese entsprechende Genexpressions-Muster gefunden werden. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit die Hochregulierung einiger bekannter RAG exklusiv infolge der peripheren Axotomie verifiziert, beispielsweise für Gap43, Sprr1a und Bdnf. Allerdings waren die meisten dieser Gene nicht signifikant methyliert. Folglich wurde zusätzlich eine Promotor-CGI-Analyse von RAG und DM-Genen durchgeführt, um DNA-Sequenz-basierte Voraussagen zum Promotor-Methylierungsmuster machen zu können. Fast alle der untersuchten Gene, insbesondere RAG, und mit Ausnahme von Sprr1a, besaßen mindestens eine oder mehrere CpG-Inseln in deren proximalen Promotorregion oder nahe der Transkriptions-Startseite (TSS). Im Vergleich zu RAG zeigten DM-Gene durchschnittlich eine höhere normalisierte CpG-Dichte im Bereich der TSS. Dabei wiesen differenziell hypermethylierte Gene höhere normalisierte CpG-Werte auf als hypomethylierte Gene, und moderat regulierte RAG höhere Werte als stark induzierte RAG.

Anschließend konnte gezeigt werden, dass die Hochregulierung wichtiger RAG infolge der peripheren Nervenverletzung mit erhöhten Leveln von Azetyl-Histon-3-Lysin-9 (H3-K9ac) und verringerten Dimethyl-Leveln (H3-K9me2) in der Promotorregion zusammenhing. Die Überexpression von PCAF (KAT2B), einer spezifischen Histon-Azetyltransferase für H3-K9, in Kulturen von dissoziierten DRG-Neuronen oder zerebellären Neuronen, verstärkte das Aus-wachsen von Neuriten, sogar auf hemmendem ZNS-Myelin. In diesem Zusammenhang wurde die myelin-induzierte Reduktion von Promotor-H3-K9ac, im Vergleich zu einem wachstums-fördernden Substrat, verhindert beziehungsweise wurde die RAG-Expression gesteigert.

Zusammenfassend scheint die Promotor-DNA-Methylierung keine wesentliche Rolle bei der Regulierung regenerations-assoziierter Gene im Allgemeinen zu spielen, allerdings dennoch für bestimmte induzierte Gene. Hingegen ist speziell die H3-K9-Azetylierung für die RAG-Regulierung nach peripherer Axotomie von Bedeutung und fördert das Neuritenwachstum. Durch Überexpression von PCAF und durch die folgende erhöhte Promotor-Histonazety-lierung konnte sogar der hemmende Effekt von Myelin in vitro überwunden werden und ein gewisses Maß an Regeneration in kultivierten DRG-Neuronen oder CGN erreicht werden. Diese Studie konnte erfolgreich zeigen, dass bestimmte epigenetische Mechanismen an der Genregulation im Rahmen der Axonregeneration beteiligt sind. Dennoch ist das Gesamtbild zum Verständnis dieser Regulierung noch lange nicht vollständig. Weitere Studien sind dringend erforderlich und könnten dazu beitragen, kombinierte klinische Therapien für die Behandlung traumatischer Rückenmarksverletzungen zu entwickeln.