Characterization of Parkinson’s disease associated DJ-1 mutants and influence of alpha-synuclein on glial cells

Abstract

Mutations in the DJ-1 gene are rare causes of early onset autosomal recessive Parkinson’s disease. DJ-1 is a ubiquitously expressed, cytoprotective protein. The most severe Parkinson’s disease associated mutations of DJ-1 lead to absence of the protein. In this work three novel Parkinson’s disase associated DJ-1 mutants were characterized. In the assays used in this work point mutation of A179 to T did not lead to different protein properties compared to the wild type DJ-1 protein. In contrast, point mutation of the conserved A107 to P and point deletion of the conserved P158 lead to decreased dimerization ability, decreased protein steady state levels and an abnormal binding behaviour towards apoptosis signal regulating kinase 1 (ASK1). In addition, in a cell cultural model of multiple system atrophy, DJ-1A107P was only partly able and DJ-1P158del was not able to reduce the p25alpha dependent microtubule retraction in an alpha-synuclein overexpressing oligodendroglial cell line, an event where also ASK1 was shown to be involved in. In conclusion, the DJ-1P158del and DJ-1A107P mutants may contribute to neurodegeneration by protein destabilization and hence loss of DJ-1 functions. The pathological hallmark of Parkinson’s disease is intracellular inclusions that mainly consist of misfolded alpha-synuclein, a protein that is normally localized in synapses and the cell body of neurons. However, part of the cellular alpha-synuclein is secreted to the extracellular space. In this work the effect of extracellular alpha-synuclein on astrocytes was investigated. A cell culture model where primary mouse astrocytes were treated with recombinant purified alpha-synuclein was used. Treatment with alpha-synuclein induced inflammatory responses in the astrocytes. This was seen by increased expression of inducible NO-synthase, cyclooxygenase-2, interleukin-6 and interleukin-1kappa, increased NO production, increased nuclear translocation of nuclear factor kappaB and increased phosphorylation of c-Jun N-terminal kinase and p38. The induction was decreased in Tlr4-/- astrocytes, thus indicating that alpha-synuclein is activating the toll like receptor 4 (TLR4) signaling pathway. Furthermore, the primary astrocytes internalized the recombinant alpha-synuclein. After removal of the protein from the cell media a fast decrease in internalized alpha-synuclein was observed. This may have been caused by proteasomal degradation. In conclusion, elevated levels of extracellular alpha-synuclein can induce astrocytes to produce cytokines and NO in a TLR4 dependent manner and thereby worsen the stress conditions in parkinsonial brains. The astrocytes may also be able to sequester and degrade extracellular alpha-synuclein.

DJ-1 ist ein ubiquitär exprimiertes, zellschützendes Protein. Selten vorkommende Mutationen des DJ-1-Gens sind assoziiert mit dem frühen Beginn der familiär-rezessiven Parkinson-Krankheit. Die schwerwiegendsten Mutationen führen zum Verlust des Proteins. In dieser Arbeit wurden drei mit der Parkinson-Krankheit assoziierten DJ-1 Punktmutationen analysiert. Die erste Mutation von A179 zu T hat in den benutzten Analysen zu keinen geänderten Proteineigenschaften im Vergleich zum Wildtyp-DJ-1 geführt. Im Gegensatz dazu hat der Austausch des konservierten A107 zu P und die Deletion des konservierten P158 zu verringerter Dimerizierung, reduzierten Proteinmengen und einem anormalen Bindungsverhalten gegenüber apoptosis regulating kinase 1 (ASK1) geführt. Außerdem wurden die DJ-1 Mutanten in einem Zellkulturmodell für Multisystematrophie untersucht. Hier war DJ-1A107P nur zum Teil und DJ-1P158del nicht fähig oligodendrozytische Zellen gegen die von p25alpha und alpha-synuklein verursachte Zelltoxizität. Zudem wurde auch gezeigt, dass ASK1 bei dieser Zelltoxicität beteiligt ist. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass DJ-1A107P und DJ-1P158del wahrscheinlich durch Proteindestablization, und daher zum Verlust der zellschützenden Funktion des DJ-1-Proteins, zu Neurodegeneration führen. Das pathologisches Merkmal der Parkinson-Krankheit sind intraneuronale Einschlüße, welche hauptsächlich aus fehlgefaltetem alpha-synuklein bestehen. Normalerweise ist alpha-synuklein an synaptischen Vesikeln und in den Zellkörpern der Neuronen lokalisiert, jedoch ist auch ein Teil des alpha-synukleins von den Neuronen in den extrazellulären Raum abgesondert. In dieser Arbeit wurden die Auswirkungen des extrazellulären alpha-synukleins auf Astrozyten untersucht. Dafür wurde ein Zellkulturmodell eingesetzt, in dem primären Maus-Astrozyten mit rekombinantem, gereinigtem, humanem alpha-synuklein behandelt wurden. Diese Behandlung hat Entzündungsreaktionen in den Astrozyten induziert, die durch eine erhöhte Expression von induzierbarem NO-syntase (iNOS), Cyclooxygenase-2, Interleukin-6 und Interleukin-1kappa, erhöhtem NO-Produktion, erhöhter nukleärer Translokation von NF-kappaB und erhöhter Phosphorylierung von c-Jun N-Terminal Kinase (JNK) und p38 nachgewiesen wurden. Diese Induktion wurde in Tlr4-/- Astrozyten deutlich verringert, was andeutet dass extrazelluläres alpha-synuklein den Toll-like Rezeptor 4 (TLR4)-Signalweg aktiviert. Außerdem wurde gezeigt, dass die Astrozyten das rekombinante alpha-synuklein aus dem Zellmedium aufnehmen. In dieser Aufnahme scheint TLR4 keine Rolle zu spielen. In den Astrozyten wurde das aufgenommene alpha-synuklein schnell abgebaut, möglicherweise durch proteasomalen Abbau. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass erhöhte Mengen von extrazellulärem alpha-synuklein zu Entzündungsreaktionen in Astrozyten durch Aktivierung von TLR4 führen können. Demnach würden die Stressbedingungen im Gehirn eines Parkinsonpatienten-erkrankten verschlechtert werden. Zusätzlich wurde auch eine astrozytische Aufnahme und Abnahme von extrazellulären alpha-synuklein gezeigt.