Qualitative and quantitative analysis of spindle assembly checkpoint signaling in Schizosaccharomyces pombe

Abstract

The spindle assembly checkpoint (SAC) is a conserved eukaryotic surveillance mechanism, which maintains genomic integrity by delaying mitotic progression until all chromosomes have become properly attached to the mitotic spindle via their kinetochores. Malfunction of this checkpoint leads to chromosome segregation errors and has been implicated in tumorigenesis. SAC protein localization to unattached kinetochores is considered to be required for checkpoint signaling. This study shows that Schizosaccharomyces pombe checkpoint proteins display a hierarchical kinetochore localization, with Ark1 and Mph1 being the most upstream components in the signaling cascade. The sole function of Ark1 in the checkpoint is to recruit Mph1, with the N-terminal region of Mph1 being required to dock the protein to kinetochores. Both proteins are the only checkpoint components still enriching at kinetochores in cells lacking bub3, and their localization is crucial for checkpoint activity in this situation. To shed light on the connection between upstream and downstream segments of the checkpoint signaling cascade, we examined the link between Bub1 and Mad1. A conserved motif in Bub1 and the Mad1 C-terminus are required for Mad1 localization and checkpoint function. Moreover, we provide evidence for a role of Mad1 in checkpoint signaling that goes beyond its function in localizing and presenting Mad2. Reliable checkpoint signaling needs robustness towards slight SAC protein level fluctuations, as they inevitably occur due to gene expression noise. We observed that slight changes in checkpoint protein abundance can strongly affect SAC signaling. To avoid this critical zone, cells keep the noise of relevant checkpoint proteins low. Some abundance changes caused non-genetic variability in checkpoint signaling, with one population of cells failing to arrest in mitosis and the other population maintaining a mitotic arrest. We describe stoichiometric inhibition of Slp1 as the basis for this population split. In addition, changes in nutrient conditions influence Slp1 abundance, which suggests that cells respond to changes in the environment by altering checkpoint signaling. Taken together, the SAC protein interaction network structure and SAC protein abundance are equally important for reliable checkpoint signaling.

Der ‘Spindle assembly checkpoint’ (SAC) ist ein konservierter, eukaryontischer, zellulärer Überwachungsmechanismus, der die genomische Integrität aufrechterhält, indem er das Fortschreiten der Mitose verzögert bis alle Chromosomen über ihre Kinetochore korrekt mit der mitotischen Spindel verknüpft sind. Fehlfunktionen dieses Kontrollmechanismus führen zu Fehlern in der Chromosomensegregation und können zur Tumorentstehung beitragen. SAC-Proteine binden an unangeheftete Kinetochoren, was als Voraussetzung für das Entstehen des SAC-Signals angesehen wird. Diese Studie zeigt, dass Schizosaccharomyces pombe SAC-Proteine hierarchisch an unangeheftete Kinetochore binden, und die Signalkaskade mit den Proteinen Ark1 und Mph1 beginnt. Die Lokalisation von Mph1 ist die einzige Funktion von Ark1 im Checkpoint. Die N-terminale Region in Mph1 ist dabei notwendig, um das Protein ans Kinetochor zu bringen. Beide Proteine sind die einzigen SAC-Proteine, die in Zellen mit fehlendem Bub3 noch an unangeheftete Kinetochore binden und ihre Lokalisation ist essentiell um einen aktiven Checkpoint aufrechtzuerhalten. Um zu verstehen wie obere und untere Segmente der SAC-Signalkaskade miteinander verknüpft sind, haben wir die Verbindung zwischen dem Bub1 und Mad1 untersucht. Ein konserviertes Motiv in Bub1 und der C-terminus von Mad1 sind notwendig, damit Mad1 an Kinetochore binden kann. Mad1 hat zudem eine Rolle im Checkpoint, die über die bekannte Funktion hinausgeht Mad2 an unangehefteten Kinetochoren zu präsentieren. Entscheidend für ein zuverlässiges SAC-Signal ist dessen Robustheit gegenüber kleinen Veränderungen in der Menge an SAC-Proteinen, wie sich durch Genexpressions-Rauschen entstehen. Überraschenderweise fanden wir, dass geringe Änderungen der SAC-Proteinmengen das SAC-Signal stark beeinflussen können. Um diese kritische Zone zu vermeiden, halten die Zellen das Protein-Rauschen in engen Grenzen. Einige Proteinmengen-Veränderungen verursachten eine nicht-genetische Signal-Variabilität, bei der nur ein Teil der Population einen stabilen mitotischen Arrest aufrechterhält. Die stöchiometrische Inhibierung von Slp1 kann das Aufspalten in zwei Population erklären. Zusätzlich zeigen wir, dass Änderungen der Nährstoffbedingungen die Slp1-Proteinmenge beeinflussen, was darauf hinweist, dass Zellen auf Unterschiede des Milieus mit einer Veränderung des SAC-Signals reagieren. Zusammenfassend sind sowohl das SAC-Protein-Interaktionsnetzwerk als auch die SAC-Proteinmenge gleichermaßen wichtig für ein zuverlässiges SAC-Signal.