The Role of Insulin and Insulin Signaling in Eye Growth Regulation

Abstract

The prevalence of myopia in the human population has dramatically increased in developed regions of Asia (Lin, 1999) but also in Western societies during the last decades (Vitale, 2009) and it is estimated that more than 30% of the worldwide population is currently myopic (Dirani, 2006). Although myopia is not a life-threatening disease, high myopia (more than 6 diopters) increases the risk of secondary diseases, such as myopic choroidal neovascularization, retinal degeneration, retinal detachment and glaucoma and thus the risk of becoming blind. It is therefore important to study the mechanisms underlying eye growth regulation. The interest in studying the role of insulin in myopia development and to investigate the underlying molecular pathways is mainly based on three different key findings. First, it was previously found that glucagon, a peptide hormone with opposite metabolic effects to those of insulin, acts as a “STOP” signal for myopia development in the chicken model of myopia (Bitzer, 2002). Two parallel studies proved that, in fact, glucagon and insulin have opposite effects on axial eye growth as well (Feldkaemper, 2009; Zhu, 2009), with insulin acting as a “GO” signal. In 2002, Cordain and collaborators stated that “during the last years diet has changed. Diets high in refined starches such as bread and cereals increase insulin levels in humans". It was further hypothesized that “high levels of insulin lead to a fall of insulin-binding protein 3 which could disturb the coordination of the eye ball lengthening and lens growth…” Second, Reitner and collaborators (2003) stated that “in the rat retina insulin receptor kinase activity does not fluctuate with the feeding/fasting cycle which is different from the systemic insulin suggesting a tissue-specific signaling pathway in the retina tissue”. Third, Heidenreich et al., (1983) observed fundamental differences especially in the subunits structure between insulin receptor molecules in brain and peripheral target tissues supporting the idea that insulin might have additional functions in neuronal tissues.

Based on these findings, the purpose of Project 1 of this thesis was to investigate, which transcript variants of the insulin receptor exist in the fundal layers of the eye (retina, RPE, choroid and sclera) compared to those found in liver and brain, and to elucidate whether these variants are involved in eye growth regulation. Another purpose of Project 1 was to quantify changes in mRNA levels for insulin, IGF-1, insulin receptor (IR) and IGF-1 receptor (IGF-1R), all present in all fundal layers in the eye, after treatment with negative spectacle lenses which induce excessive eye growth and positive spectacle lenses, which stopped the eye from growing. Different treatment durations were chosen to investigate the time course of the transcriptional changes. Project 2 was based on the results of Project 1, in which it was shown that the regulation of IR - and IGF-1R mRNA expression levels is specific to the type and duration of the imposed defocus. Since the binding of insulin to IR or IGF-1R can activate two different pathways, the downstream signaling cascades were analyzed in more detail. The objective of Project 2 was to study the effect of intravitreal insulin injections on the activation of the PI3K/Akt or MEK/Erk signaling pathways in the retina during imposed myopic or hyperopic defocus. In addition the effects of two pathway- specific inhibitors on refractive development were investigated. The purpose of Project 3 was to compare biometric measurements in the eye with A-scan ultrasonography (the “3M Echo Rule”) and a new commercially available low coherence interferometer (the “Lenstar LS-900” by Haag Streit, Switzerland). This project was relevant because the chicken model is frequently used in myopia research and no gold-standard technique is available for biometry in the chicken.

Die Häufigkeit von Myopie stieg in den letzten Jahrzehnten vor allem in industrialisierten Regionen in Asien (Lin, 1999), aber auch in westlichen Ländern (Vitale, 2009), dramatisch an; so waren 2006 schätzungsweise 30% der Weltbevölkerung kurzsichtig (Dirani, 2006). Kurzsichtigkeit ist zwar kein lebensbedrohlicher Zustand, das Risiko durch Folgeerkrankungen wie z.B. Choroidale Neovaskularisation, Nethautdegeneration und – Ablösung oder Glaukom zu erblinden ist bei hoher Myopie (> 6 Dioptrien) jedoch deutlich höher. Aufgrund dieses Risikos sind Studien zur Erforschung des der Myopie zugrundeliegenden Mechanismus unabdingbar. Das Interesse an dem Zusammenhang zwischen Insulin und der Ausbildung von Myopie und den zugrundeliegenden molekularen Signalwegen basiert auf drei grundlegenden Gedanken: Erstens wurde festgestellt, dass Glukagon (ein Peptidhormon mit gegensätzlichen metabolischen Effekten wie Insulin) als „STOP“ Signal für das axiale Augenlängenwachstum im Tiermodell Huhn fungiert (Bitzer, 2002). Zwei voneinander unabhängige Studien zeigten, dass die Applikation von Insulin und Glukagon gegensätzliche Auswirkungen auf das axiale Augenlängenwachstum haben (Feldkaemper, 2009; Zhu, 2009), und dass eben dieses durch Insulin gefördert wird. Im Jahre 2002 schrieben Cordain et al., dass sich die Ernährung in der letzten Jahren verändert hat und die Zunahme an prozessierten Karbohydraten im Brot und anderen Getreideprodukten den Insulinspiegel bei Menschen erhöhen könnte. Weiterhin wurde vermutet, dass ein hoher Insulinspiegel zu einer Abnahme des Insulin-binding Proteins 3 (IBP3) führen kann, welche wiederum die Koordination zwischen dem Augenlängenwachstum und der Ausbildung der Linse beeinträchtigen kann und somit zu einer Verschiebung der Refraktion führt. Zweitens führten Reitner et al. Im Jahre 2003 eine Studie durch die zeigte, dass in der Netzhaut der Ratte die Aktivität der Insulin Rezeptor Kinase unabhängig vom Fütterungszyklus ist, durch die systemische Gabe von Insulin jedoch beeinflusst wird. Dies führte zu der Schlussfolgerung, dass in der Netzhaut ein für Insulin gewebespezifischer Signalweg vorliegt. Drittens entdeckten Heidenreich et al. bereits 1983 fundamentale strukturelle Unterschiede zwischen Insulinrezeptoren im Gehirn und in peripheren Geweben, was darauf schliessen lässt dass Insulin noch andere Funktionen in neuronalem Gewebe auslöst als die bisher bekannten. In Projekt No.1 wurde untersucht, welche Varianten des Insulinrezeptors in den Schichten des Auges vorkommen (Netzhaut, retinales Pigmentepithel, Aderhaut und Sklera), und ob sich diese von den Insulinrezeptoren der Leber und des Gehirns unterscheiden. Zusätzlich wurde festgestellt, ob sich die mRNA Level von Insulin, Insulinrezeptor (IR) und Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1), welche alle in den verschiedenen Schichten des Auges exprimiert werden, ändern wenn das axiale Augenlängenwachstum durch Behandlung mit Minuslinsen erhöht oder durch Behandlung mit Pluslinsen hemmt. Unterschiedliche Behandlungszeiten ermöglichten die Bestimmung des Zeitverlaufes der Änderung der Transkription. Projekt No.2 basiert auf den Ergebnissen von Projekt No.1, wo gezeigt werden konnte dass die IR – und IGF-1 mRNA Expressionslevel je nach Art und Dauer der verwendeten Defokussierung reguliert werden. Da durch die Bindung von Insulin an den IR oder an den IGF-1R zwei verschiedene Mechanismen aktiviert werden können, wurden die weiterführenden Signalkaskaden detaillierter untersucht. Hierzu wurde der Effekt von intravitrealer Gabe von Insulin auf die Aktivierung der PI3K/Akt oder der MEK/Erk Signalkaskade in der Netzhaut während gleichzeitiger hyperoper oder myoper Defokussierung bestimmt. Zusätzlich wurde der Effekt von für PI3K/Akt oder MEK/Erk spezifischer Inhibitoren auf die Entwicklung der Refraktion gemessen. Projekt No.3 befasste sich mit dem Vergleich zweier biometrischer Messmethoden, der A-scan Ultrasonografie („3M Echo Rule“) und einem seit kurzem käuflichen low coherence interferometer (“Lenstar LS-900” von Haag Streit, Schweiz). Diese Untersuchung war wichtig, da das Huhn ein sehr häufig verwendetes Tiermodell in der Kurzsichtigkeitsforschung ist und für die biometrischen Messungen bisher keine Standard-Methode etabliert wurde.