Prozessentwicklung für die Produktion des Lipopeptid-Antibiotikums Friulimicin in Actinoplanes friuliensis

Abstract

Friulimicin ist ein hochwirksames Antibiotikum gegen gram positive multiresistente Bakterien wie methicillinresistente Staphylokokken und Enterokokken (MRS, MRE). Zum besseren Verständnis der Biosynthese und zur Untersuchung von Möglichkeiten zur Steigerung der Produktivität des Lipopeptid-Antibiotikums Friulimicin in dem „seltenen Aktinomyzeten“ Actinoplanes friuliensis wurden verschiedene Modellprozesse entwickelt. Für die Entwicklung von Modellprozessen und zur Charakterisierung der Friulimicinbiosynthese in A. friuliensis wurde ein chemisch definiertes Nährmedium verwendet. In diesem definierten Nährmedium konnte der Einfluss von einzelnen Nährmedienbestandteilen auf die physiologischen und morphologischen Eigenschaften des Myzelbildners A. friuliensis untersucht und Nährmedienanpassungen zur Steigerung der Biomasse und der Friulimicinausbeute vorgenommen werden. Aus den Kultivierungen mit definiertem Nährmedium wurden zudem Ansätze für die Entwicklung von Prozessführungsstrategien und Möglichkeiten zur erweiterten Prozessanalyse abgeleitet. Bei der Entwicklung von Prozessführungsstrategien zeigten Fed-Batch-Prozesse großes Potential zur Steigerung der Produktivität von Friulimicin. Der Nährmedienbestandteil Phosphat ist essentiell für das Zellwachstum und die Aktivität der Zellen. Höhere Phosphatkonzentrationen erwiesen sich allerdings als inhibierend auf die Friulimicinbiosynthese. Durch limitierte Zufütterung von Phosphat konnte die Friulimicinproduktionsphase bei gleichzeitigem Wachstum verlängert werden. Neben Phosphat zeigte auch das Nebenprodukt Ammonium eine inhibierende Wirkung auf die Friulimicinbiosynthese. Durch die Zufütterung der Kohlenhydratquelle Glucose konnte die Ammoniumbildung vermieden werden. Als besonders geeignete Prozessführungsstrategie erwies sich ein kontinuierlicher Prozess mit Zellrückhaltung. Die volumetrische Produktivität von Friulimicin konnte durch diesen Prozesstyp im Vergleich zu Batch-Prozessen und Fed Batch-Prozessen um ein Mehrfaches gesteigert werden. Um die Prozessentwicklung effizienter zu gestalten, wurde während Kultivierungen von A. friuliensis der Einsatz von onlinefähigen Messmethoden wie Mittelinfrarotspektroskopie und Impedanzspektroskopie untersucht. Die Mittelinfrarotspektroskopie (micro biolytics GmbH, Esslingen) zeigte sich als wenig aufwendige Methode zur Verfolgung einer größeren Anzahl an Prozessparametern und zur Identifikation der Nebenproduktbildung. Die Impedanzspektroskopie lieferte ein aussagekräftiges Online-Signal für die Biomasse und war eine gute Ergänzung zur Biotrockenmassebestimmung, die bei myzelförmig wachsenden Mikroorganismen fehlerträchtig ist. Zur Unterstützung der Prozessentwicklung, wurden die Daten aus den Kultivierungen von A. friuliensis zur Stoffflussanalyse in einem genombasierten Stoffwechselmodell verwendet (Insilico Biotechnology, Stuttgart). Diese Analysen ermöglichten ein tiefgehendes Verständnis der Friulimicinbiosynthese in A. friuliensis und können zur Prozessoptimierung sowohl auf Ebene der Prozessführung als auch auf genetischer Ebene beitragen.

Friulimicin is a highly potent antibiotic, which is active against a broad range of multiresistant gram-positive bacteria such as methicillin-resistant Staphylococcus and Enterococcus spec. (MRS, MRE) strains. For better understanding of the biosynthesis and for investigating different approaches for enhancing the productivity of the lipopeptide antibiotic friulimicin in the “rare actinomycete” Actinoplanes friuliensis different model processes were developed. For the development of these model processes and for the characterisation of friulimicin biosynthesis in A. friuliensis, a chemically defined medium was used. In this medium the influence of medium components on the physiological and morphological properties of the filamentous growing strain were investigated. Furthermore the composition of the medium was adapted in order to increase the yields of biomass and friulimicin. From cultivations with defined medium, approaches for the development of process control strategies and enhanced process analysis were derived. During the development of process control strategies, fed-batch cultivations showed high potential for increasing the productivity of friulimicin. Phosphate, which is a component of the defined medium, is essential for growth and activity of the cells, but inhibited friulimicin biosynthesis. By limited feeding of phosphate the friulimicin production phase could be prolonged and parallel growth activity occurred. Not only phosphate but also the by-product ammonium inhibited friulimicin biosynthesis. By feeding of glucose, formation of ammonium could be prevented. During the process development a continuous process with cell retention was shown to be particularly favourable for friulimicin production. Compared to a batch and fed-batch process the volumetric productivity was increased at least by a factor of two. In order to improve the efficiency of process development the use of online analytical methods like middle infrared and dielectric spectroscopy were tested during cultivations. The middle infrared spectroscopy (micro biolytics GmbH, Esslingen) was a suitable method for analysing a huge number of substrates and for identifying by-product formation. As an alternative for the analysis of cell dry weight, which is error prone for filamentous growing microorganisms, dielectric spectroscopy turned out to be suitable and delivered an online signal for biomass. Data from cultivations of A. friuliensis were also used to support the process development by metabolic flux analysis in a genome derived metabolic model (Insilico Biotechnology, Stuttgart). With these analyses a more precise understanding of the friulimicin biosynthesis in A. friuliensis was possible. Therefore, these analyses might contribute to the process optimization with respect to the improvement of process control strategies as well as on genetic level.