Kontrolle des Wachstums HPV-positiver Zerviskarzinomzellen durch virale und zelluläre Proteine

Abstract

Infektionen mit bestimmten HPV Typen wie HPV16 oder 18 können zur Entstehung von Karzinomen des Gebärmutterhalses (Zervixkarzinom, CxCa) führen. Interessanterweise ist für das Wachstum von CxCa-Zellen eine kontinuierliche Expression der HPV E6 und E7 Onkoproteine notwendig. E6 und E7 inaktivieren Zellzykluskontrollpunkte und verhindern die Induktion von Apoptose. Daher werden seit längerem unterschiedliche Möglichkeiten intensiv erforscht, die Expression der Onkoproteine in Karzinomzellen zu inhibieren. Eine Möglichkeit besteht in der RNA-Interferenz gegen E6/E7 Transkripte und eine andere in der Überexpression der HPV E2 oder E8^E2C Regulatorproteine, welche den E6/E7 Promotor transkriptionell inhibieren. Während allen Methoden gemeinsam ist, dass das Wachstum von CxCa-Zellen inhibiert wird, sind die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen der Wachstumsinhibition im Fall von E8^E2C gänzlich unbekannt und werden für die RNA Interferenz und die E2-Expression unterschiedlich diskutiert. Es zeigte sich, dass die wachstumsinhibierenden Effekte von HPV E8^E2C und E2 Proteinen hauptsächlich auf der Inhibition der E6/E7 Transkription beruht. Der Verlust von E6 und E7 in CxCa-Zellen führte nach zwei Tagen zu einem moderaten Anstieg der Apoptoserate und zu einem Zellzyklusarrest in der G1-Phase. Die langfristige Inhibition von E6/E7 durch E8^E2C oder E2 induzierte zelluläre Seneszenz in HeLa-Zellen. Allerdings zeigten Untersuchungen in HPV-negativen, immortalisierten Zelllinien, dass E8^E2C auch E6/E7-unabhängig das Zellwachstum verlangsamt. Dies beruht vermutlich auf verringerter Zelladhäsion und einer Reduktion der Zellzahl in der G2-Phase nach Expression des Regulatorproteins. Das lässt vermuten, dass E8^E2C nicht nur die HPV E6/E7-Transkription inhibiert, sondern auch zelluläre Gene beeinflussen kann und daher als Gentherapeutikum nur bedingt geeignet ist. Bei Untersuchungen zur Apoptoseregulation in CxCa-Zellen stellte sich heraus, dass das zelluläre p14ARF Protein, welches generell als Tumorsuppressor betrachtet wird, in allen untersuchten CxCa-Zellen, jedoch nicht in HPV-negativen Zellen, überexprimiert wird. Überraschenderweise beeinträchtigte der siRNA-vermittelte Verlust von p14ARF das Wachstum von HPV16- oder 18-positiven CxCa-Zellen. Dieser Phänotyp war spezifisch auf den Verlust von p14ARF zurückzuführen, da die Effekte mit der Effizienz der p14ARF Reduktion korrelierten und durch die Überexpression einer siRNA-resistenten Form von p14ARF aufgehoben werden konnten. Die Verringerung der p14ARF Menge führte zu DNA Fragmentierung, einem Verlust des mitochondrialen Membranpotentials und der Spaltung von Caspase 3, was nahelegte, dass p14ARF die Apoptoseinduktion durch das Mitochondrium verhindert. Damit einher ging die signifikante Reduktion der Mcl-1 Proteinmenge. Mcl-1 ist ein anti-apoptotisches Mitglied der Bcl2 Proteinfamilie und für die Aufrechterhaltung des mitochondrialen Membranpotentials verantwortlich. Der „Knockdown“ der E3 Ubiquitinligase Mule, welche in Verbindung mit der proteasomalen Degradation von Mcl-1 gebracht wird, die Aufhebung der siARF-vermittelten Apoptose durch Überexpression einer nicht-degradierbaren Form von Mcl-1, sowie publizierte Daten legen nahe, dass in CxCa-Zellen p14ARF Mule inhibiert und somit ausreichend Mcl-1 vorhanden ist, um die mitochondriale Apoptose zu verhindern.

Publikationen zeigten, dass CxCa-Zellen resistent gegenüber der Apoptoseinduktion durch extrazelluläre Todesliganden wie TRAIL sind und dass dies auf der Expression von Mcl-1 beruht. Im Einklang damit konnte die TRAIL-Resistenz von CxCa-Zellen durch den p14ARF „Knockdown“ überkommen werden. Vergleiche von HPV-negativen mit E6/E7-exprimierenden Zellen und die Inhibition der E6/E7-Expression in CxCa-Zellen belegen, dass die transkriptionelle Induktion von p14ARF in HPV-positiven Zellen eine Konsequenz der HPV E6/E7 Expression ist. Die mangelnde Korrelation zwischen p14ARF Transkripten und Proteinmenge in unterschiedlichen HPV-positiven Zelllinien, Proteasomeninhibitorexperimente und der „Knockdown“ des p14ARF assoziierten nukleolären Nucleophosmin-Proteins demonstrieren darüber hinaus, dass post-translationale Mechanismen zur Überexpression des p14ARF Proteins in CxCa-Zellen beitragen. Zusammenfassend weisen die Daten darauf hin, dass p14ARF eine CxCa-spezifische Zielstruktur für neue Therapieansätze darstellen könnte

The oncoproteins E6/E7 are responsible for the cellular transformation and the continuous growth of cervical cancer cells (CxCa). Thus, repression of E6/E7 expression seems to be a potent intention to induce apoptosis in CxCa cells. HPV genome encodes two regulator/repressor proteins E2 and the E8ˆE2C. Transcript analyses of several HPV have demonstrated that the viral E2 gene encodes both the E2 regulator protein and the E8ˆE2C protein, which differ in their aminotermini. Contradictory results have been published about the effects of E2 and E8ˆE2C expression. Comparative analysis of E2, E8ˆE2C demonstrated all proteins inhibited potently HPVE6/E7 oncogene promoters and this rapidly increased the protein level of the E6 and E7 target p53. Expression of the repressor proteins induced a cell cycle arrest in the G1-phase and senescence markers but not apoptosis. Same effects were observed after knockdown of E6/E7 via siRNA. In summary, the siRNA experiments have shown, that the effects of E2 and E8ˆE2C are only due to the loss of E6 and E7. To further investigate in the induction of apoptosis, we examined different proteins, which are supposed to be involved in apoptosis regulation. The tumour suppressor p14ARF, encoded by the INK4a/ARF locus, triggers cell cycle arrest and sensitizes cells to apoptosis in the presence of collateral signals. Expression of p14ARF can be induced by oncogenic signals, but it is often disrupted in human cancers. To clarify the p14Arf status in cervical cancers CxCa cells, different CxCa cell lines were analysed. All CxCa cell lines express wild-type ARF whereas (uninfected) normal human keratinocytes ( NHK) does not. Silencing of the tumour suppressor p14Arf resulted in an increased of DNA fragmentation and cleavage of Caspase3. Two different siRNAs were used to exclude side effects. Further investigation in this surprisingly results shown, that the knock down of p14ARF with both siRNAs increases the apoptosis induction only in cervical CaCx cells not in NHKs. The overexpression of p14Arf in Hela cells demonstrated, that exogenous p14Arf has no effect on apoptosis induction or cell cycle regulation. Moreover, the overexpression of p14Arf prevented the cells to undergo siArf induced apoptosis. Flow cytometry analysis of the mitochondrial membrane potential (MMP) after p14Arf silencing established a correlation between the lost of p14Arf and the reduction of MMP. Mule (Arf-BP1, LASU), a HECT-domain-containing ubiquitin ligase, is an interaction partner of p14ARF and it is descripted to catalyzes the polyubiquitination of anti-apoptotic protein Mcl-1. Furthermore, p14Arf antagonizes functions of Mule and thus could stabilize Mcl-1 levels. Comparative analysis of Mcl-1 protein levels after silencing of p14Arf and Mule verified that theory. Reduction in the Mcl-1 protein expression was observed after the knockdown of p14Arf, whereas the knockdown of Mule results in a stabilization of Mcl-1. Combination of siRNA against p14Arf and the siRNA against Mule led to an increase of Mcl-1 compared to the single p14Arf knock down. In Hela cells we were also able to reduce the siArf induced apoptosis levels, via the additional silencing of Mule. Taken together our results suggest that p14ARF does not act as a tumour suppressor in CxCa, but also prevents mitochondrial apoptosis in these cells. In summary the data indicate that p14ARF might act as a CxCa specific target for noval therpeutical approaches.